灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz)作為重要的藥用植物,在我國(guó)普遍種植,其有效成分綠原酸(chlorogenicacid,CGA)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物,具有清熱解毒、抗菌、抗病毒等重要的藥用價(jià)值。而目前有關(guān)灰氈毛忍冬綠原酸合成的分子機(jī)制以及關(guān)鍵酶基因的研究還不夠深入,因此,本論文從基因克隆、綠原酸測(cè)定、表達(dá)模式分析、原核表達(dá)、以及載體構(gòu)建等方面入手,對(duì)灰氈毛忍冬綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA克隆及定量表達(dá)分析,以期為研究灰氈毛忍冬綠原酸生物合成的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)采用RACE方法,克隆了灰氈毛忍冬綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT的全長(zhǎng)cDNA序列,結(jié)果顯示Lm4CL基因全長(zhǎng)1960 bp(GenBank:MN103349),CDS 全長(zhǎng) 1617bp,編碼 539 個(gè)氨基酸,LmHCT基因得到部分片段 840 bp,LmCCoAOMT基因全長(zhǎng) 1096 bp(GenBank:MN103348),CDS全長(zhǎng)735 bp,編碼245個(gè)氨基酸。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn),灰氈毛...

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 藥用植物的研究進(jìn)展
    1.2 植物綠原酸生物合成的研究進(jìn)展
    1.3 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)
    1.4 植物綠原酸合成關(guān)鍵酶基因研究現(xiàn)狀
        1.4.1 4CL基因的研究進(jìn)展
        1.4.2 HCT基因的研究進(jìn)展
        1.4.3 CCoAOMT基因的研究進(jìn)展
    1.5 本文研究的工作設(shè)想
        1.5.1 研究目的與意義
        1.5.2 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線
第2章 灰氈毛忍冬Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 材料的采集與處理
        2.2.2 總RNA的提取
        2.2.3 cDNA第一鏈的合成
        2.2.4 Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因中間片段引物設(shè)
        2.2.5 RACE技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理以及目的基因全長(zhǎng)cDNA的克隆
        2.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.8 目的基因與載體的連接
        2.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.10 PCR反應(yīng)體系及程序
        2.2.11 Lm4CL、LmCCoAOMT的生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 Lm4CL基因的全長(zhǎng)cDNA克隆
        2.3.2 LmHCT基因的全長(zhǎng)cDNA克隆
        2.3.3 LmCCoAOMT基因的全長(zhǎng)cDNA克隆
        2.3.4 Lm4CL基因序列分析
        2.3.5 LmCCoAOMT基因序列分析
        2.3.6 Lm4CL、LmCCoAOMT生理生化性質(zhì)分析
        2.3.7 Lm4CL、LmCCoAOMT二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
    2.4 小結(jié)
第3章 灰氈毛忍冬關(guān)鍵酶基因表達(dá)模式分析
    3.1 材料和試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Lm4CL、LmHCT和LmCCoAOMT引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄
        3.2.3 定量PCR分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 Lm4CL基因的表達(dá)模式分析
        3.3.2 LmHCT基因的表達(dá)模式分析
        3.3.3 LmCCoAOMT基因的表達(dá)模式分析
    3.4 小結(jié)
第4 關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與綠原酸含量相關(guān)性分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 綠原酸含量的測(cè)定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 4CL基因表達(dá)量與綠原酸含量相關(guān)性分析
        4.3.2 HCT基因表達(dá)量與綠原酸含量相關(guān)性分析
        4.3.3 CCoAOMT基因表達(dá)量與綠原酸含量相關(guān)性分析
    4.4 小結(jié)
第5章 灰氈毛忍冬綠原酸合成關(guān)鍵基因的原核表達(dá)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 酶切與酶連
        5.2.2 大腸桿菌BL21(star)感受態(tài)的制備
        5.2.3 大腸桿菌BL2l(star)轉(zhuǎn)化
        5.2.4 Lm4CL和LmCCoA OMT基因的原核表達(dá)
        5.2.5 目的蛋白的純化
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 Lm4CL基因的原核表達(dá)
        5.3.2 LmCCoAOMT基因的原核表達(dá)
    5.4 小結(jié)
第6章 Lm4CL、LmCCoAOMT基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        6.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 Lm4CL-1301過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
        6.3.2 LmCCoAOMT-1301過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
    6.4 小結(jié)
第7章 結(jié)論與討論
參考文獻(xiàn)
附錄A 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
附錄B 參與項(xiàng)目課題
附錄C 基因登錄號(hào)
致謝



本文編號(hào)：3857119