灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz)作為重要的藥用植物,在我國普遍種植,其有效成分綠原酸(chlorogenicacid,CGA)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物,具有清熱解毒、抗菌、抗病毒等重要的藥用價值。而目前有關(guān)灰氈毛忍冬綠原酸合成的分子機制以及關(guān)鍵酶基因的研究還不夠深入,因此,本論文從基因克隆、綠原酸測定、表達模式分析、原核表達、以及載體構(gòu)建等方面入手,對灰氈毛忍冬綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因進行全長cDNA克隆及定量表達分析,以期為研究灰氈毛忍冬綠原酸生物合成的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。本論文的主要研究內(nèi)容如下:(1)采用RACE方法,克隆了灰氈毛忍冬綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT的全長cDNA序列,結(jié)果顯示Lm4CL基因全長1960 bp(GenBank:MN103349),CDS 全長 1617bp,編碼 539 個氨基酸,LmHCT基因得到部分片段 840 bp,LmCCoAOMT基因全長 1096 bp(GenBank:MN103348),CDS全長735 bp,編碼245個氨基酸。通過聚類分析發(fā)現(xiàn),灰氈毛...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 藥用植物的研究進展
    1.2 植物綠原酸生物合成的研究進展
    1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)
    1.4 植物綠原酸合成關(guān)鍵酶基因研究現(xiàn)狀
        1.4.1 4CL基因的研究進展
        1.4.2 HCT基因的研究進展
        1.4.3 CCoAOMT基因的研究進展
    1.5 本文研究的工作設(shè)想
        1.5.1 研究目的與意義
        1.5.2 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
第2章 灰氈毛忍冬Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    2.1 實驗材料與儀器
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 材料的采集與處理
        2.2.2 總RNA的提取
        2.2.3 cDNA第一鏈的合成
        2.2.4 Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT基因中間片段引物設(shè)
        2.2.5 RACE技術(shù)的實驗原理以及目的基因全長cDNA的克隆
        2.2.6 PCR擴增產(chǎn)物的膠回收
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.8 目的基因與載體的連接
        2.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.10 PCR反應(yīng)體系及程序
        2.2.11 Lm4CL、LmCCoAOMT的生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 Lm4CL基因的全長cDNA克隆
        2.3.2 LmHCT基因的全長cDNA克隆
        2.3.3 LmCCoAOMT基因的全長cDNA克隆
        2.3.4 Lm4CL基因序列分析
        2.3.5 LmCCoAOMT基因序列分析
        2.3.6 Lm4CL、LmCCoAOMT生理生化性質(zhì)分析
        2.3.7 Lm4CL、LmCCoAOMT二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測
    2.4 小結(jié)
第3章 灰氈毛忍冬關(guān)鍵酶基因表達模式分析
    3.1 材料和試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 Lm4CL、LmHCT和LmCCoAOMT引物設(shè)計
        3.2.2 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄
        3.2.3 定量PCR分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 Lm4CL基因的表達模式分析
        3.3.2 LmHCT基因的表達模式分析
        3.3.3 LmCCoAOMT基因的表達模式分析
    3.4 小結(jié)
第4 關(guān)鍵酶基因表達量與綠原酸含量相關(guān)性分析
    4.1 實驗材料
    4.2 實驗方法
        4.2.1 綠原酸含量的測定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 4CL基因表達量與綠原酸含量相關(guān)性分析
        4.3.2 HCT基因表達量與綠原酸含量相關(guān)性分析
        4.3.3 CCoAOMT基因表達量與綠原酸含量相關(guān)性分析
    4.4 小結(jié)
第5章 灰氈毛忍冬綠原酸合成關(guān)鍵基因的原核表達
    5.1 實驗材料
    5.2 實驗方法
        5.2.1 酶切與酶連
        5.2.2 大腸桿菌BL21(star)感受態(tài)的制備
        5.2.3 大腸桿菌BL2l(star)轉(zhuǎn)化
        5.2.4 Lm4CL和LmCCoA OMT基因的原核表達
        5.2.5 目的蛋白的純化
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 Lm4CL基因的原核表達
        5.3.2 LmCCoAOMT基因的原核表達
    5.4 小結(jié)
第6章 Lm4CL、LmCCoAOMT基因過表達載體的構(gòu)建
    6.1 實驗材料
    6.2 實驗方法
        6.2.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        6.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 Lm4CL-1301過表達載體的構(gòu)建
        6.3.2 LmCCoAOMT-1301過表達載體的構(gòu)建
    6.4 小結(jié)
第7章 結(jié)論與討論
參考文獻
附錄A 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
附錄B 參與項目課題
附錄C 基因登錄號
致謝



本文編號：3857119