蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是一年生豆科苜蓿屬植物,因其具有基因組小,遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點,是繼擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)之后的第三個完成全基因組完整測序的模式植物。由于其與紫花苜蓿等豆科植物的親緣關(guān)系較近,相關(guān)基因的研究也可以為紫花苜蓿及其它豆科植物提供參考和借鑒。本研究對蒺藜苜蓿A17葉片進行不同時長(0、3、8 h)的干旱處理,取樣后進行轉(zhuǎn)錄組測序,每次處理重復(fù)3次,共計9個樣品。通過對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的挖掘及加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)分析,構(gòu)建加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò),探究蒺藜苜蓿干旱逆境脅迫下脯氨酸的積累機制,試驗共計找到三個關(guān)鍵模塊,其中LightCyan模塊相關(guān)性最高(cor=-1),并在LightCyan模塊中確定一個模塊身份值(MM)較高的醛脫氫酶基因家族基因Medtr2g042330,通過鑒定蒺藜苜蓿全基因組下的醛脫氫酶基因家族:將Medtr2g042330命名為MtALDH7A1,并對其進行試驗驗證:首先采用實時熒光定量qPCR技術(shù)檢測不同干旱脅迫處理下地上和地下部位MtALDH7A1基因的表達模式,驗證轉(zhuǎn)錄...

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 植物抗旱性研究進展
        1.1.1 干旱脅迫處理對植物表型的影響
        1.1.2 干旱脅迫處理對植物生理的影響
        1.1.3 干旱脅迫處理對植物基因表達的影響
    1.2 脯氨酸的積累機制
        1.2.1 脯氨酸的合成與降解
        1.2.2 脯氨酸的轉(zhuǎn)運
    1.3 轉(zhuǎn)錄組研究
        1.3.1 利用基因芯片及轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)的方法進行轉(zhuǎn)錄組分析
    1.4 加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)理論基礎(chǔ)
    1.5 醛脫氫酶基因
        1.5.1 醛脫氫酶基因在植物應(yīng)對非生物脅迫中的功能
        1.5.2 醛脫氫酶基因在植物生長發(fā)育中的功能
    1.6 研究目的及意義
    1.7 研究內(nèi)容
第二章 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料及脅迫處理
        2.1.2 酶及試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 蒺藜苜蓿RNA的提取
        2.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建及上機測序
    2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        2.3.1 測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾
        2.3.2 序列比對到參考基因組
        2.3.3 基因表達定量
        2.3.4 差異表達基因的篩選及韋恩分析與趨勢分析
        2.3.5 候選目標(biāo)基因Gene Ontology(GO)富集分析
        2.3.6 候選目標(biāo)基因pathway富集分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 測序結(jié)果統(tǒng)計
        2.4.2 與參考基因組比對分析
        2.4.3 基因表達定量分析
        2.4.4 差異表達基因分析
        2.4.5 差異表達基因GO富集分析
        2.4.6 差異表達基因KEGG pathway富集分析
    2.5 小結(jié)
第三章 加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)分析脯氨酸代謝相關(guān)基因
    3.1 試驗材料
        3.1.1 植物材料(同2.1.1)
        3.1.2 儀器設(shè)備
        3.1.3 試驗試劑
    3.2 脯氨酸含量的測定
    3.3 加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
        3.3.1 表達數(shù)據(jù)的導(dǎo)入、過濾及轉(zhuǎn)置
        3.3.2 構(gòu)建加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)
        3.3.3 加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)與脯氨酸含量進行關(guān)聯(lián)分析
        3.3.4 選定模塊樞紐基因進行可視化
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 蒺藜苜蓿不同干旱時期脯氨酸含量測定
        3.4.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理及軟閾值的選擇
        3.4.3 基因模塊的確定
        3.4.4 脯氨酸含量與模塊關(guān)聯(lián)分析
        3.4.5 核心基因篩選及kegg富集分析
        3.4.6 核心基因可視化分析
    3.5 小結(jié)
第四章 蒺藜苜蓿醛脫氫酶基因家族的全基因組鑒定
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗方法
        4.2.1 蒺藜苜蓿ALDH基因家族的全基因組鑒定與染色體定位
        4.2.2 蒺藜苜蓿ALDH基因家族的系統(tǒng)進化樹分析
        4.2.3 基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析
        4.2.4 MTALDH啟動子中的順式元件分析
        4.2.5 靶向MtALDH基因的miRNA的預(yù)測
        4.2.6 基因表達譜和基因本體富集分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 MtALDH基因的全基因組鑒定
        4.3.2 蒺藜苜蓿ALDH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類
        4.3.3 蒺藜苜蓿ALDH基因的結(jié)構(gòu)與功能域分析
        4.3.4 保守基序的分析
        4.3.5 家族內(nèi)部基因的重復(fù)事件分析
        4.3.6 miRNA分析
        4.3.7 順式作用元件分析
        4.3.8 基因表達模式分析
        4.3.9 基因GO及 KEGG pathway富集分析
    4.4 小結(jié)
第五章 蒺藜苜蓿MTALDH7A1 基因的克隆及構(gòu)建載體
    5.1 植物材料與儀器試劑
        5.1.1 植物材料(同2.1.1)
        5.1.2 載體、試劑、儀器
        5.1.3 培養(yǎng)基及相關(guān)抗生素的配制
    5.2 MTALDH7A1 基因的表達分析
        5.2.1 qRT-PCR引物設(shè)計
        5.2.2 實時熒光定量檢測MtALDH7A1 基因
    5.3 MTALDH7A1 基因的克隆
        5.3.1 引物設(shè)計
        5.3.2 蒺藜苜蓿RNA的提取
        5.3.3 cDNA的合成
        5.3.4 MtALDH7A1 基因的擴增
        5.3.5 PCR產(chǎn)物的回收
    5.4 MTALDH7A1 基因過表達載體的構(gòu)建
        5.4.1 載體片段的酶切
        5.4.2 目的片段與載體連接
        5.4.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選
        5.4.4 質(zhì)粒提取
    5.5 結(jié)果與分析
        5.5.1 MtALDH7A1 基因的克隆
        5.5.2 MtALDH7A1 基因過表達載體的構(gòu)建
    5.6 小結(jié)
第六章 蒺藜苜蓿MTALDHA1 基因的擬南芥轉(zhuǎn)化及初步功能驗證
    6.1 試驗材料
        6.1.1 植物材料及菌株
        6.1.2 培養(yǎng)基及抗生素的配制
    6.2 試驗方法
        6.2.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        6.2.2 農(nóng)桿菌的電轉(zhuǎn)化
        6.2.3 蘸花法轉(zhuǎn)染擬南芥
        6.2.4 MtALDH7A1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的逐代篩選
        6.2.5 MtALDH7A1 基因?qū)M南芥抗旱、耐鹽性的影響
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的草銨膦抗性篩選及PCR鑒定
        6.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的草銨膦抗性篩選及PCR鑒定
    6.4 小結(jié)
第七章 討論與結(jié)論
    7.1 討論
    7.2 結(jié)論
    7.3 本研究創(chuàng)新點
    7.4 展望
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：3849048