蝗綠僵菌(Metarhizium acridum)是一類十分重要的模式真菌。在真菌中,肽酶在影響真菌適應(yīng)性方面發(fā)揮著重要的作用,而二肽酶(dipeptidase)的功能研究仍然少見。二肽酶能夠?qū)⒍乃庑纬蓛蓚�(gè)游離的氨基酸,對(duì)生物體糖代謝及氨基酸代謝具有十分重要的意義。目前,C69家族二肽酶dipeptidase(PepD)在真菌中功能尚未見報(bào)道。因此,本文以昆蟲病原真菌蝗綠僵菌為研究對(duì)象,分析了其酶學(xué)特性,闡明了該二肽酶基因(MaPepD)在蝗綠僵菌中的功能,并對(duì)該基因參與調(diào)控相關(guān)表型的機(jī)制進(jìn)行了探索。主要獲得了以下研究結(jié)果:(1)大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)獲得MaPepD蛋白,該蛋白分子量為56-kDa,酶活性為240 U/mg,K_m為1640 mM。該二肽酶最適pH 6.0最適溫度是55°C。(2)缺失MaPepD基因后,分生孢子在1/4 SDAY培養(yǎng)基上萌發(fā)率提高,對(duì)紫外、濕熱、細(xì)胞壁破壞劑抗性增加,但菌株毒力不受影響。(3)收集1/4 SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的孢子進(jìn)行RNA-Seq分析,結(jié)果表明:MaPepD可能介導(dǎo)了細(xì)胞壁合成...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
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英文摘要
1 緒論
    1.1 引言與研究背景
        1.1.1 昆蟲病原真菌及其研究進(jìn)展
        1.1.2 微循環(huán)產(chǎn)孢的研究進(jìn)展
        1.1.3 肽酶基因功能的研究進(jìn)展
    1.2 研究意義
    1.3 研究目的
    1.4 研究內(nèi)容
    1.5 技術(shù)路線
2 蝗綠僵菌二肽酶基因MaPepD功能研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.1.2 質(zhì)粒載體
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與試劑盒
        2.1.4 主要培養(yǎng)基
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)溶液的配置
        2.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.7 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 MaPepDcDNA閱讀框全長的克隆
        2.2.2 MaPepD基因生物信息學(xué)分析
        2.2.3 試劑盒大量提取真菌基因組DNA
        2.2.4 綠僵菌總RNA提取方法
        2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞熱轉(zhuǎn)化
        2.2.6 用試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物
        2.2.7 MaPepD基因敲除及回復(fù)載體的構(gòu)建
        2.2.8 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL-1 的化學(xué)轉(zhuǎn)化法
        2.2.9 蝗綠僵菌與根癌農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)
        2.2.10 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.2.11 Suthern bloting驗(yàn)證MaPepD敲除及回復(fù)菌株
        2.2.12 產(chǎn)孢方式分析
        2.2.13 SYA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量分析
        2.2.14 分生孢子萌發(fā)量的分析
        2.2.15 紫外濕熱抗逆性分析
        2.2.16 化學(xué)物質(zhì)耐受性分析
        2.2.17 真菌粗酶提取方法
        2.2.18 蛋白濃度測定
        2.2.19 原核表達(dá)及純化
        2.2.20 LC-MS定量分析氨基酸含量
        2.2.21 蝗綠僵菌MaPepD粗酶活性測定
        2.2.22 MaPepD酶活性測定
        2.2.23 MaPepD最適p H及最適溫度測定
        2.2.24 MaPepD對(duì)二肽底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
        2.2.25 外源添加氨基酸對(duì)產(chǎn)孢方式的影響
        2.2.26 毒力實(shí)驗(yàn)分析
        2.2.27 RNA-Seq分析MaPepD對(duì)產(chǎn)孢方式的影響
        2.2.28 RNA-Seq分析MaPepD對(duì)抗逆性的影響
        2.2.29 定量PCR驗(yàn)證
        2.2.30 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 MaPepD基因生物信息學(xué)分析
        2.3.2 MaPepD酶學(xué)特性分析
        2.3.3 MaPepD敲除及回復(fù)載體的構(gòu)建
        2.3.4 MaPepD基因?qū)染G僵菌產(chǎn)孢方式的影響
        2.3.5 MaPepD基因調(diào)控蝗綠僵菌在SYA上產(chǎn)孢量及生長
        2.3.6 MaPepD基因影響蝗綠僵菌生長及萌發(fā)率
        2.3.7 MaPepD基因影響孢子的濕熱、UV-B抗性
        2.3.8 MaPepD基因影響蝗綠僵菌逆境耐受性
        2.3.9 LC-MS檢測氨基酸水平發(fā)生改變
        2.3.10 ΔMa PepD二肽酶活性顯著降低
        2.3.11 外源添加β-Ala回復(fù)微循環(huán)產(chǎn)孢
        2.3.12 敲除MaPepD后菌株毒力無影響
        2.3.13 MaPepD調(diào)控蝗綠僵菌產(chǎn)孢模式轉(zhuǎn)換的機(jī)制分析
        2.3.14 MaPepD調(diào)控孢子抗逆性機(jī)制分析
    2.4 討論
3 主要結(jié)論及后續(xù)工作建議
    3.1 本研究的主要結(jié)論
    3.2 后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排
參考文獻(xiàn)
附錄
    A 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文的目錄
    B 本研究所用引物序列
        附表1 本研究所用載體構(gòu)建引物序列
        附表2 微循環(huán)產(chǎn)孢調(diào)控DGE結(jié)果
        附表3 微循環(huán)產(chǎn)孢DEGs定量引物
        附表4 分生孢子抗逆性DGE結(jié)果
        附表5 孢子抗逆性DEGs定量引物
        附表6 LC-MS氨基酸代謝組定量結(jié)果
        附圖1 QRSD分析
    C MaPepD的cDNA序列
    D 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號(hào)：3819455