基因組編輯是利用序列特異核酸酶在基因組特定位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂,激活細胞自身的修復(fù)機制(非同源末端連接或同源重組),實現(xiàn)基因敲除、染色體重組以及基因定點插入或替換的技術(shù)。當有外源DNA或者病毒入侵,CRISPR/Cas系統(tǒng)會將入侵的序列片段整合進去,由特定的crRNA進行同源序列的降解。該系統(tǒng)構(gòu)建簡單、精準度高、成本低、能同時對多個位點進行定點編輯。本研究探索了利用豌豆早褐病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的關(guān)鍵因子crRNA和Cas9蛋白在煙草中表達,期望實現(xiàn)對煙草基因進行編輯。主要結(jié)果如下:1、設(shè)計煙草PDS基因的目標編輯序列,設(shè)計引物擴增,酶切,與酶切后的pCAPE2-GFP連接獲得pCAPE2:crRNA載體。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法獲得遍在表達Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因系。將pCAPE1和pCAPE2:crRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌1:1混合后侵染遍在表達Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因系,但未能發(fā)現(xiàn)基因組編輯表型。2、獲得煙草的crRNA序列。通過擴增得到Cas9片段,將載體和兩個片段各自酶切,通過T4連接酶對該三片段進...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
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前言
第一章 文獻綜述
    1.1 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展介紹
        1.1.1 基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.1.2 人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯
        1.1.3 基因組編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用問題
    1.2 CRISPR/Cas簡述
        1.2.1 CRISPR的研究歷史
        1.2.2 CRISPR/Cas技術(shù)進行基因編輯的基本原理
    1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的特點
        1.3.1 CRISPR/Cas的基因結(jié)構(gòu)
        1.3.2 CRISPR/Cas的技術(shù)結(jié)構(gòu)
    1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在魚類中的應(yīng)用
        1.4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在老鼠中的應(yīng)用
        1.4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用
    1.5 病毒誘導(dǎo)的基因沉默
        1.5.1 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的發(fā)現(xiàn)
        1.5.2 RNA病毒誘導(dǎo)的基因沉默
        1.5.3 其他病毒誘導(dǎo)的基因沉默
        1.5.4 VIGS病毒載體的應(yīng)用
        1.5.5 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的優(yōu)缺點
    1.6 本項目的目的和意義
第二章 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 實驗試劑和菌株
    2.2 病毒介導(dǎo)crRNA在遍在表達Cas9蛋白的煙草轉(zhuǎn)基因系中編輯
        2.2.1 PDS基因靶點序列設(shè)計
        2.2.2 crRNA的構(gòu)建
        2.2.3 PEBV載體的處理
        2.2.4 單酶切pCAPE2-GFP質(zhì)粒和酶切后的crRNA片段進行連接
        2.2.5 鏈接產(chǎn)物做DH5α（E.coli細胞 ）轉(zhuǎn)化
        2.2.6 重組克隆的篩選
        2.2.7 質(zhì)粒的提取與轉(zhuǎn)化
            2.2.7.1 質(zhì)粒的提取和純度測量
            2.2.7.2 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
            2.2.7.3 培養(yǎng)保存轉(zhuǎn)化好的農(nóng)桿菌
        2.2.8 獲得遍在表達Cas9蛋白轉(zhuǎn)基因系用pCAPE2：crRNA注射侵染
    2.3 病毒介導(dǎo)Cas9和crRNA在煙草中編輯
        2.3.1 Cas9和crRNA片段的獲得
        2.3.2 Cas9和crRNA的片段的酶切
        2.3.3 對pCAPE2-GFP載體的雙酶切
        2.3.4 pCAPE2：Cas9-crRNA載體片段的拼接
        2.3.5 pCAPE2：Cas9-crRNA病毒載體的注射
        2.3.6 表型分析
    2.4 病毒介導(dǎo)crRNA在配子特異表達Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因系中編輯
        2.4.1 NtDMC1啟動子的處理
        2.4.2 Cas9蛋白的整合
            2.4.2.1 BP反應(yīng)
            2.4.2.2 LR反應(yīng)
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 病毒介導(dǎo)crRNA在遍在表達Cas9基因的煙草轉(zhuǎn)基因系中的編輯結(jié)果
        3.1.1 crRNA的構(gòu)建
        3.1.2 pCAPE2-GFP的單酶切和雙酶切結(jié)果
        3.1.3 pCAPE2:crRNA載體驗證及其轉(zhuǎn)化檢測
        3.1.4 遍在表達Cas9基因的煙草轉(zhuǎn)基因系的構(gòu)建
        3.1.5 病毒載體pCAPE2：crRNA對遍在表達Cas9株系侵染
    3.2 病毒介導(dǎo)Cas9和crRNA在煙草中的編輯結(jié)果
        3.2.1 Cas9和crRNA片段的擴增結(jié)果
        3.2.2 連接轉(zhuǎn)化DH5α，質(zhì)粒提取
        3.2.3 質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果
        3.2.4 無菌苗注射后的表型分析
        3.2.5 基因組編輯序列的檢驗
    3.3 病毒介導(dǎo)crRNA在配子特異表達Cas9轉(zhuǎn)基因系中的編輯結(jié)果
        3.3.1 獲得NtDMC1的片段
        3.3.2 將Cas9基因轉(zhuǎn)移到入門載體
        3.3.3 pH7WG:NtDMC1：Cas9載體的構(gòu)建驗證
第四章 討論
    4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的突變效率影響因素
    4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組定點編輯的特異性
第五章 結(jié)論
參考文獻
致謝
個人簡歷



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