溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作為海洋水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的主要病原之一,給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重危害。因此,需對(duì)溶藻弧菌病菌進(jìn)行有效的防控。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system,T3SS)作為溶藻弧菌的毒力因子與其致病性關(guān)系密切,Vsc B蛋白和Vsc D蛋白是Ⅲ型分泌系統(tǒng)重要組成部分,可能在溶藻弧菌侵染宿主的過(guò)程發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)以溶藻弧菌T3SS的vsc B和vsc D基因作為研究對(duì)象,分別克隆了vsc B和vsc D基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),vsc B基因長(zhǎng)為429 bp,編碼142個(gè)氨基酸,理論分子量為16.4k Da,p I值為5.48;vsc D基因長(zhǎng)1302 bp,編碼了433個(gè)氨基酸,分子量為47.9k Da,理論p I值為4.98。通過(guò)氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示,溶藻弧菌的Vsc B與副溶血弧菌的蛋白相似度最高,達(dá)到91%,而溶藻弧菌的Vsc D與魔鬼弧菌(Vibrio diabolicus)的蛋白相似度最高,達(dá)到97%。同時(shí)分別構(gòu)建了p ET-28a-vsc B和p ET-32a-vsc D原核表達(dá)載體,分別對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了可...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 溶藻弧菌的研究進(jìn)展
        1.1.1 溶藻弧菌的主要生物學(xué)特征
        1.1.2 溶藻弧菌的致病因子
    1.2 革蘭氏陰性菌的蛋白分泌系統(tǒng)(ProteinSecretionSystem)
    1.3 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeIIIsecretionsystem,T3SS)
    1.4 研究目的和意義
2 vscB和vscD基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    2.1 材料
        2.1.1 載體及菌株
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
    2.2 方法
        2.2.1 溶藻弧菌HY9901菌株基因組的抽提
        2.2.2 vscB和vscD基因的克隆
        2.2.3 目的片段與載體的連接及測(cè)序
        2.2.4 生物信息學(xué)分析方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 vscB和vscD基因的全長(zhǎng)克隆
        2.3.2 VscB和VscD的理化性質(zhì)
        2.3.3 VscB和VscD序列分析
        2.3.4 同源性和進(jìn)化分析
        2.3.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
        2.3.6 VscB和VscD的功能域預(yù)測(cè)
        2.3.7 VscB和VscD三級(jí)結(jié)構(gòu)
    2.4 討論
3 溶藻弧菌VscB和VscD的原核表達(dá)
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 方法
        3.2.1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒
        3.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.3 表達(dá)產(chǎn)物VscB和VscD蛋白的純化
        3.2.4 Westernblot檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 pET-28a-vscB和pET-32a-vscD表達(dá)載體的鑒定
        3.3.2 pET-28a-vscB和pET-32a-vscD的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 表達(dá)產(chǎn)物VscB和VscD蛋白的可溶性分析
        3.3.4 重組蛋白VscB和VscD蛋白的純化檢測(cè)
        3.3.5 Westernblot檢測(cè)
    3.4 討論
4 缺失株△vscB與回補(bǔ)株的構(gòu)建
    4.1 材料
        4.1.1 質(zhì)粒和菌株
        4.1.2 引物
        4.1.3 試劑
        4.1.4 儀器
    4.2 方法
        4.2.1 △vscB的構(gòu)建
        4.2.2 回補(bǔ)株vscB的構(gòu)建
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 vscB缺失片段的融合
        4.3.2 pLP12-vscB重組質(zhì)粒
        4.3.3 第一次同源重組
        4.3.4 第二次同源重組
        4.3.5 回補(bǔ)株C-vscB構(gòu)建
    4.4 討論
5 △vscB的生物學(xué)表型研究及免疫保護(hù)分析
    5.1 材料
        5.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)用魚(yú)
        5.1.2 儀器
        5.1.3 試劑
    5.2 方法
        5.2.1 缺失株△vscB的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
        5.2.2 測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線
        5.2.3 細(xì)菌泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)
        5.2.4 胞外蛋白酶活性測(cè)定
        5.2.5 生物被膜測(cè)定
        5.2.6 半數(shù)致死量的測(cè)定(LD50)
        5.2.7 免疫保護(hù)率的測(cè)定
        5.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 缺失株△vscB的遺傳穩(wěn)定性
        5.3.2 HY9901、△vscB和C-vscB的生長(zhǎng)曲線
        5.3.3 泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)
        5.3.4 胞外蛋白酶活性測(cè)定
        5.3.5 生物被膜測(cè)定
    5.4 討論
6 結(jié)論
    6.1 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)vscB和vscD基因的克隆
    6.2 vscB和vscD表達(dá)載體的構(gòu)建
    6.3 缺失株△vscB的構(gòu)建
    6.4 缺失株△vscB生物學(xué)表型研究及免疫保護(hù)分析
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3812714