近些年來發(fā)現(xiàn),黑曲霉產(chǎn)生的赭曲霉毒素A(OTA)對人類的健康具有潛在的威脅。研究發(fā)現(xiàn)OTA的合成需要一系列的酶反應,而編碼這些酶的基因成簇排列,形成基因簇。通過生物信息學分析,bZIP(Gene ID:4988390)和P450(Gene ID:4988391)基因很可能是黑曲霉OTA生物合成基因簇中的基因,與OTA合成相關。但還未驗證其功能,故本研究以產(chǎn)OTA的黑曲霉A14為出發(fā)菌株,利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法,構(gòu)建基因敲除及過表達菌株,驗證bZIP和P450基因在黑曲霉侵染和OTA合成中的作用,這將為有效地控制黑曲霉產(chǎn)毒污染及探究OTA代謝途徑提供理論基礎。本實驗運用農(nóng)桿菌介導侵染黑曲霉的方法成功篩選獲得bZIP基因敲除菌株A14AbZIP、P450基因敲除菌株A14ΔP450。利用重測序方法測得A14AbZIP和A14ΔP450菌株中HYG基因插入序列位置為:An15_Aniger_CBS₅13₈8,染色體位置為1,857,026-1,859,864和1,859,284-1,862...

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 黑曲霉
    1.2 赭曲霉毒素
    1.3 OTA生物合成研究進展
        1.3.1 OTA生物合成前體和代謝產(chǎn)物
        1.3.2 OTA可能的生物合成途徑和相關酶
        1.3.3 OTA生物合成相關基因和基因簇
        1.3.4 OTA生物合成調(diào)控機制
    1.4 bZIP轉(zhuǎn)錄因子的概述
        1.4.1 bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 真菌中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子
        1.4.3 bZIP轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用
    1.5 細胞色素P450
        1.5.1 細胞色素P450的研究概況
        1.5.2 細胞色素P450的性質(zhì)
        1.5.3 真菌中的細胞色素P450
    1.6 本課題的研究意義、目的及研究內(nèi)容
        1.6.1 本論文的研究意義
        1.6.2 主要研究內(nèi)容
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物
        2.1.2 試劑
        2.1.3 主要的儀器和設備
        2.1.4 培養(yǎng)基和溶液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 黑曲霉基因組提取
        2.2.2 bZIP基因的擴增及測序
        2.2.3 P450基因的擴增及測序
        2.2.4 敲除質(zhì)粒p890的構(gòu)建
        2.2.5 敲除質(zhì)粒p900的構(gòu)建
        2.2.6 過表達質(zhì)粒p891的構(gòu)建
        2.2.7 大腸感受態(tài)的制備
        2.2.8 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.9 黑曲霉A14對潮霉素的敏感性實驗
        2.2.10 敲除質(zhì)粒p890、p900和過表達質(zhì)粒p891分別電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌
        2.2.11 農(nóng)桿菌侵染實驗
        2.2.12 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的初篩
        2.2.13 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的復篩
        2.2.14 黑曲霉A14ΔbZIP轉(zhuǎn)化子驗證
        2.2.15 黑曲霉A14ΔP450轉(zhuǎn)化子驗證
        2.2.16 黑曲霉A14::bZIP轉(zhuǎn)化子驗證
        2.2.17 基因敲除、過表達菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗
        2.2.18 黑曲霉A14ΔbZIP和A14ΔP450中HYG插入位點及拷貝數(shù)分析
        2.2.19 黑曲霉A14、A14ΔbZIP和A14ΔP450生長速率、菌落形態(tài)及菌絲干重
        2.2.20 黑曲霉A14、A14ΔbZIP和A14ΔP450分生孢子計數(shù)
        2.2.21 黑曲霉A14、A14ΔbZIP、A14ΔP450 OTA和A14::bZIP產(chǎn)量檢測
        2.2.22 黑曲霉RNA的提取及qRT-PCR
3 結(jié)果與討論
    3.1 黑曲霉基因組的提取
    3.2 bZIP和P450基因的擴增及測序
    3.3 黑曲霉中bZIP基因和P450基因的敲除及過表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.1 敲除質(zhì)粒p890的構(gòu)建
        3.3.2 敲除質(zhì)粒p900的構(gòu)建
        3.3.3 過表達質(zhì)粒p891的構(gòu)建
    3.4 黑曲霉中A14對潮霉素的敏感性實驗
    3.5 黑曲霉中bZIP基因和P450基因的敲除及過表達菌株的構(gòu)建
        3.5.1 敲除質(zhì)粒p890電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.5.2 敲除質(zhì)粒p900電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.5.3 過表達質(zhì)粒p891電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.5.4 農(nóng)桿菌AGL-bZIP侵染黑曲霉A14的試驗
        3.5.5 農(nóng)桿菌AGL-P450侵染黑曲霉A14的試驗
        3.5.6 農(nóng)桿菌AGL-p891染黑曲霉A14的試驗
        3.5.7 基因改造菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗
    3.6 黑曲霉A14ΔbZIP和A14ΔP450中HYG基因拷貝數(shù)分析
    3.7 黑曲霉A14、ΔbZIP、A14ΔP450表型分析
        3.7.1 菌落形態(tài)觀察與生長速率對比
    3.8 黑曲霉A14、A14ΔbZIP、A14ΔP450和A14::bZIP產(chǎn)物分析
    3.9 bZIP基因?qū)谇巩a(chǎn)OTA簇內(nèi)基因的調(diào)控
4 結(jié)論
5 展望
6 參考文獻
7 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況
8 致謝
9 附錄



本文編號：3806748