目的:前期抽取30名非綜合型唇腭裂的患兒血樣,通過全外顯子測(cè)序等生物信息技術(shù)尋找非綜合型唇腭裂可能候選致病基因,篩選出突變率最高LAMA5基因rs145192286位點(diǎn)。本研究依靠前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),探究其LAMA5基因與非綜合型唇腭裂之間的關(guān)系。觀察層粘連蛋白-5(LAMA5)在小鼠胚胎腭器官發(fā)育融合過程中的時(shí)空表達(dá)變化,利用RNAi技術(shù)靶向干擾LAMA5基因,觀察腭突融合情況,了解特異性抑制靶基因下對(duì)于胚胎腭突發(fā)育融合的影響。方法:1.用斷頸脫位法在C57BL/6J孕鼠妊娠第12.5天(E12.5)、E13.5、E14.5、E15.0、E15.5處死,保留小鼠胎頭,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Western Blotting法定位、半定量檢測(cè)LAMA5蛋白在不同胚胎發(fā)育時(shí)期在腭突中的表達(dá)。2.建立體外腭器官培養(yǎng)模型,設(shè)計(jì)抑制LAMA5基因表達(dá)尾部帶有綠色熒光標(biāo)記物的shRNA腺病毒載體,將其導(dǎo)入E13.5體外培養(yǎng)腭突組織中,培養(yǎng)48h后倒置熒光顯微鏡下觀察腭突融合情況,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別檢測(cè)干擾后的基因LAMA5表達(dá)量變...

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
第一部分 LAMA5在小鼠胚胎腭突發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)變化
    實(shí)驗(yàn)材料與方法
        1.實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 研究對(duì)象
            1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        2.實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 實(shí)驗(yàn)樣本獲取
            2.2 免疫組化染色檢測(cè) LAMA5 在小鼠腭組織中的定位及表達(dá)量
            2.3 Western Blotting檢測(cè)LAMA5 在小鼠腭突中的表達(dá)變化
            2.4 免疫組化評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
            2.5 統(tǒng)計(jì)分析
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 不同時(shí)期胚胎腭突組織中LAMA5蛋白的免疫組化定位及表達(dá)量
        3.2 不同時(shí)期胚胎腭突組織中LAMA5 蛋白Western Blotting表達(dá)量
    討論
第二部分 腺病毒載體誘導(dǎo)LAMA5基因抑制體外腭突培養(yǎng)的研究
    實(shí)驗(yàn)材料和方法
        1 LAMA5-sh RNA腺病毒載體構(gòu)建流程及滴度測(cè)定
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2 體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)腭突及抑制LAMA5重組腺病毒轉(zhuǎn)染鑒定
            2.1 實(shí)驗(yàn)材料
                2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象
                2.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
                2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.2 實(shí)驗(yàn)方法
                2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組
                2.2.2 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染腭突
                2.2.3 RT-PCR檢測(cè)LAMA5的mRNA表達(dá)量
                2.2.4 Western Blotting檢測(cè)LAMA-5的mRNA表達(dá)量
            2.3 數(shù)據(jù)分析
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 熒光顯微鏡下觀察腺病毒干擾后腭突融合情況
        3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腺病毒干擾效率及LAMA5的mRNA表達(dá)量
        3.3 Western Blotting檢測(cè)腺病毒干擾后LAMA5 蛋白表達(dá)量
    討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
中英縮略詞對(duì)照表
致謝



本文編號(hào)：3786590