中華蜜蜂是我國特有的授粉昆蟲,對維持我國生態(tài)系統(tǒng)的平衡性方面具有重要作用。近年來,冷脅迫問題在我國頻繁發(fā)生,對中華蜜蜂的生存造成極大影響。褪黑素是一種胺類激素,最新研究表明褪黑素能夠幫助生物體提高耐寒性,但其能否提高中華蜜蜂的耐寒性,目前還未見報道。因此本研究以中華蜜蜂為實驗材料,通過在飼糧中添加外源褪黑素的方法,探索最佳飼喂?jié)舛?并檢測低溫脅迫下中華蜜蜂體內抗氧化酶的活性、氧化物質的含量和耐寒性物質的含量,從生理性角度加以揭示外源褪黑素對中華蜜蜂抗寒性的影響;通過分離獲得褪黑素合成通路中的色氨酸羥化酶AccT5H-1基因,并研究其基因作用機理,從分子水平探討內源褪黑素對中華蜜蜂抗寒性的影響,為進一步開發(fā)出提高中華蜜蜂抗寒能力的褪黑素飼料提供理論基礎。主要研究結果如下:(1)在中華蜜蜂日常的飼糧中添加10μg/mL的褪黑素,蜜蜂在低溫下的存活率最高。(2)低溫脅迫下,飼糧中添加外源褪黑素后提高了中華蜜蜂體內的甘油和糖原的含量,增強了中華蜜蜂的耐寒性。(3)低溫脅迫下,外源飼喂褪黑素可以提高中華蜜蜂體內的抗氧化酶的活性和Vc含量,降低了氧化物質(MDA和H₂O

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 昆蟲的耐寒性
        1.1.1 昆蟲的耐寒性定義
        1.1.2 昆蟲的耐寒策略
        1.1.3 昆蟲的過冷卻現(xiàn)象及耐寒類型
    1.2 影響昆蟲耐寒性的因素
        1.2.1 氣溫的季節(jié)變化
        1.2.2 低溫馴化
        1.2.3 棲息地緯度和海拔的差異
        1.2.4 其他生物因素
    1.3 褪黑素的研究進展
        1.3.1 褪黑素的發(fā)現(xiàn)與合成
        1.3.2 褪黑素的功能
    1.4 色氨酸羥化酶的研究進展
        1.4.1 色氨酸羥化酶的結構與分類
        1.4.2 色氨酸羥化酶的功能
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 蜜蜂材料
        2.1.2 菌株與載體
        2.1.3 酶與各種生化試劑
        2.1.4 PCR引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 中華蜜蜂的飼養(yǎng)與處理
        2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.2.3 AccT5H-1基因編碼區(qū)的獲取
        2.2.4 目的DNA片段的回收
        2.2.5 目的DNA片段的連接與轉化
        2.2.6 大腸桿菌質粒DNA的提取
        2.2.7 中華蜜蜂總RNA的提取
        2.2.8 反轉錄cDNA的合成
        2.2.9 實時熒光定量PCR分析基因的表達水平
        2.2.10 雙鏈RNA的合成
        2.2.11 RNA干擾AccT5H-1
        2.2.12 Acc T5H-1基因沉默后部分抗氧化基因的轉錄水平的測定
        2.2.13 Acc T5H-1基因沉默后抗氧化酶的活性的測定
        2.2.14 AccT5H-1 基因沉默后氧化物質和Vc含量測定
        2.2.15 飼喂褪黑素后蜜蜂體內抗氧化酶的活性測定
        2.2.16 飼喂褪黑素后蜜蜂體內氧化物質和Vc含量測定
        2.2.17 飼喂褪黑素后蜜蜂體內甘油和糖原的含量測定
3 結果與分析
    3.1 外源褪黑素濃度的篩選及相關研究
        3.1.1 外源褪黑素濃度的篩選
        3.1.2 低溫脅迫下外源褪黑素對中華蜜蜂抗氧化酶活性的影響
        3.1.3 低溫脅迫下外源褪黑素對中華蜜蜂氧化物質和Vc含量的影響
        3.1.4 低溫脅迫下外源褪黑素對中華蜜蜂耐寒物質含量的影響
        3.1.5 低溫脅迫下外源褪黑素對中華蜜蜂褪黑素合成關鍵酶AccT5H-1基因表達量的影響
    3.2 AccT5H-1基因的克隆及生物信息學分析
        3.2.1 AccT5H-1基因的克隆
        3.2.2 中華蜜蜂AccT5H-1蛋白結構分析
        3.2.3 中華蜜蜂AccT5H-1啟動子序列的順勢作用元件預測
        3.2.4 中華蜜蜂AccT5H-1基因組結構分析
    3.3 中華蜜蜂AccT5H-1在低溫脅迫條件下的表達特性
    3.4 RNAi介導的中華蜜蜂AccT5H-1 基因沉默
        3.4.1 中華蜜蜂AccT5H-1基因沉默鑒定
        3.4.2 中華蜜蜂AccT5H-1基因沉默后抗氧化基因的表達分析
        3.4.3 中華蜜蜂AccT5H-1基因沉默后對抗氧化酶活性的影響
        3.4.4 中華蜜蜂AccT5H-1 基因沉默后對中華蜜蜂體內氧化物質和Vc含量的影響
4 討論
    4.1 外源褪黑素對中華蜜蜂耐寒性的影響
        4.1.1 外源褪黑素濃度的確定
        4.1.2 外源褪黑素對中華蜜蜂體內耐寒指標的影響
        4.1.3 外源褪黑素對中華蜜蜂體內抗氧化酶的影響
        4.1.4 外源褪黑素對中華蜜蜂體內氧化物質和Vc含量的影響
    4.2 AccT5H-1基因與褪黑素在低溫下的影響
        4.2.1 AccT5H-1基因蛋白結構分析
        4.2.2 RNAi介導的AccT5H-1 基因沉默
        4.2.3 AccT5H-1基因表達特性分析
5 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3784825