發(fā)布時(shí)間：2023-04-05 08:28

　　植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能受到一定的生物脅迫與非生物脅迫。植物響應(yīng)非生物脅迫時(shí)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng),以適應(yīng)不同的環(huán)境變化。DNMTs是植株DNA甲基化過(guò)程中重要的甲基轉(zhuǎn)移酶。目前關(guān)于植物體內(nèi)DNA甲基過(guò)程中DNMT2的作用機(jī)制和功能性分析實(shí)驗(yàn)研究較少,因此,研究DNMT2基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中或植物抗逆性過(guò)程中的功能和作用,對(duì)提高作物抗性和品質(zhì)具有重要意義。本文以模式植物番茄(Solanum lycopersicum)為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得11種物種中DNMT2蛋白的氨基酸序列,然后通過(guò)DNMAN軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)保守域的分析,發(fā)現(xiàn)這些氨基酸序列具有相對(duì)比較保守的蛋白結(jié)構(gòu)域。對(duì)這11種蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析和DNA甲基化結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果表明番茄SlDNMT2蛋白與馬鈴薯St DNMT2蛋白的親緣關(guān)系較近,同源性高達(dá)95.54%。同時(shí)構(gòu)建SlDNMT2的多個(gè)植物表達(dá)載體進(jìn)行一系列生理生化分析。首先,構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體p ART27-SlDNMT2-e GFP觀察SlDNMT2蛋白的亞細(xì)胞定位情況,結(jié)果表明SlDNMT2蛋白定位于細(xì)胞核中。利用植物基因...

【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 DNA甲基化
        1.1.1 植物DNA甲基化的概念
        1.1.2 DNA甲基化作用的關(guān)鍵酶—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶
        1.1.3 DNA甲基化應(yīng)用及其前景
    1.2 植物抗逆性研究
        1.2.1 生物脅迫與非生物脅迫
        1.2.2 植物抗逆性的研究進(jìn)展與意義
    1.3 轉(zhuǎn)基因番茄的研究現(xiàn)狀
    1.4 RNA干擾技術(shù)在植物基因組學(xué)中的應(yīng)用
        1.4.1 RNA干擾技術(shù)的概念
        1.4.2 RNA干擾技術(shù)要點(diǎn)及其應(yīng)用
    1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法及其在基因工程中的應(yīng)用
        1.5.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化機(jī)理
        1.5.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法影響因素
        1.5.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用前景
    1.6 植物組培及其在基因組學(xué)中的應(yīng)用
        1.6.1 植物組培的概念
        1.6.2 植物組培的關(guān)鍵要素及其應(yīng)用前景
    1.7 植物蛋白亞細(xì)胞定位及其在基因工程中的應(yīng)用
        1.7.1 亞細(xì)胞定位的概念和機(jī)理
        1.7.2 亞細(xì)胞定位的應(yīng)用前景
    1.8 本實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)內(nèi)容
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 材料與儀器設(shè)備
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒
        2.1.3 相關(guān)引物信息
    2.2 實(shí)驗(yàn)中主要儀器設(shè)備
        2.2.1 本實(shí)驗(yàn)中主要儀器
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)器皿
    2.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
        2.3.1 本實(shí)驗(yàn)中涉及的相關(guān)酶
        2.3.2 本實(shí)驗(yàn)中涉及的相關(guān)化學(xué)試劑
    2.4 本實(shí)驗(yàn)中常用的試劑耗材
    2.5 相關(guān)試劑和培養(yǎng)基的配制
        2.5.1 分子實(shí)驗(yàn)中相關(guān)培養(yǎng)基的配制
        2.5.2 分子實(shí)驗(yàn)中相關(guān)試劑的配制
        2.5.3 植物組織培養(yǎng)中常用試劑的配制
        2.5.4 植物組織培養(yǎng)中相關(guān)植物激素的配制
        2.5.5 植物組織培養(yǎng)中相關(guān)培養(yǎng)基的配制
        2.5.6 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)試劑的配置
    2.6 相關(guān)引物設(shè)計(jì)
        2.6.1 引物設(shè)計(jì)原則
        2.6.2 引物設(shè)計(jì)基本步驟
    2.7 植株總RNA提取
    2.8 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
        2.8.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
        2.8.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增程序
    2.9 SlDNMT2 擴(kuò)增
        2.9.1 SlDNMT2 PCR反應(yīng)體系
        2.9.2 SlDNMT2 PCR反應(yīng)程序
    2.10 番茄RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.10.1 特異性片段siRNA1的克隆
            2.10.1.5 實(shí)驗(yàn)步驟
        2.10.2 si RNA1與p SK載體的酶切、連接
        2.10.3 特異性片段siRNA1陽(yáng)性鑒定
        2.10.4 特異性片段siRNA2克隆
        2.10.5 特異性片段siRNA2陽(yáng)性鑒定
        2.10.6 p SK-si RNA重組質(zhì)粒鑒定
        2.10.7 p SK-si RNA質(zhì)�？焯釞z測(cè)
        2.10.8 重組質(zhì)粒的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證
        2.10.9 重組質(zhì)粒的切膠回收
        2.10.10 SlDNMT2-si RNA與 p BI121 連接
    2.11 SlDNMT2 亞細(xì)胞定位
        2.11.1 融合表達(dá)載體構(gòu)建
        2.11.2 煙草瞬時(shí)表達(dá)
    2.12 SlDNMT2 組織特異性表達(dá)分析
    2.13 番茄植株的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.13.1 大腸桿菌DH5α的制備
        2.13.2 制備農(nóng)桿菌感受態(tài)(CaCl2法)
        2.13.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物純化
        2.13.4 SlDNMT2 與中間載體連接
        2.13.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.13.6 菌落PCR鑒定
        2.13.7 SlDNMT2 酶切鑒定
        2.13.8 SlDNMT2 測(cè)序和序列分析
        2.13.9 p BI121-SlDNMT2-si RNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.13.10 農(nóng)桿菌單克隆陽(yáng)性鑒定
    2.14 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
        2.14.1 發(fā)種子
        2.14.2 預(yù)培養(yǎng)
        2.14.3 農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng)
        2.14.4 篩選培養(yǎng)
        2.14.5 生根培養(yǎng)
    2.15 煉苗與移栽
    2.16 DNA水平的陽(yáng)性鑒定
    2.17 RNA水平的陽(yáng)性鑒定
        2.17.1 定量PCR組分
        2.17.2 定量PCR反應(yīng)程序
        2.17.3 實(shí)驗(yàn)步驟
    2.18 非生物脅迫下的表型分析
        2.18.1 鮮重分析
        2.18.2 植株高度分析
        2.18.3 植株側(cè)根數(shù)分析
        2.18.4 氣孔數(shù)分析
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 SlDNMT2 生物信息學(xué)分析
    3.2 SlDNMT2 基因c DNA序列克隆
    3.3 SlDNMT2 表達(dá)模式分析
    3.4 SlDNMT2 亞細(xì)胞定位分析
    3.5 SlDNMT2 特異性片段si RNA克隆
    3.6 siRNA1特異性序列陽(yáng)性鑒定
    3.7 siRNA2特異性序列陽(yáng)性鑒定
    3.8 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證
    3.9 SlDNMT2 RNAi表達(dá)載體正確性檢測(cè)
    3.10 預(yù)培養(yǎng)
    3.11 共培養(yǎng)
    3.12 K60篩選培養(yǎng)
    3.13 K65篩選培養(yǎng)
    3.14 K70篩選培養(yǎng)
    3.15 生根培養(yǎng)
    3.16 轉(zhuǎn)基因植株DNA水平的陽(yáng)性鑒定
    3.17 轉(zhuǎn)基因植株RNA水平的定量分析
    3.18 鹽脅迫條件下的表型分析
    3.19 甘露醇脅迫條件下的表型分析
    3.20 二價(jià)重金屬離子脅迫時(shí)的表型分析
    3.21 干旱環(huán)境下轉(zhuǎn)基因植物的表型分析
    3.22 轉(zhuǎn)基因植物葉片中氣孔情況的分析
    3.23 番茄中Sl TINY1、Sl SAG1 基因半定量分析
第四章 結(jié)果與討論
    4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
    4.2 展望與討論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況



本文編號(hào)：3783090