球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一類廣泛分布于自然界的重要昆蟲病原真菌,其宿主范圍十分廣泛,它不僅能引起野外昆蟲的感染及疾病流行,其中一些菌株還是家蠶的重要病原菌。家蠶的體壁表皮是阻礙病原真菌侵染的第一道天然屏障,對免疫防御病原菌的入侵具有重要作用,在球孢白僵菌粘附在家蠶體壁和穿透表皮的過程中,蠶體會發(fā)生一系列的生理、病理及免疫反應(yīng),球孢白僵菌侵染相關(guān)基因也會對此作出相應(yīng)的特異性應(yīng)答。因此,尋找和鑒定球孢白僵菌此過程涉及的相關(guān)基因及其功能不僅對進(jìn)一步揭示球孢白僵菌的致病機(jī)制具有重要意義,同時也能為尋找新的防治家蠶白僵病的策略奠定基礎(chǔ)。家蠶球孢白僵菌菌株(GXsk1011)是本實驗室從家蠶中分離鑒定出的一株高毒力菌株,在本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn),該菌株在應(yīng)答3種不同昆蟲表皮的過程中,一個被轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析注釋為球孢白僵菌細(xì)胞表面蛋白的基因Bbcsp1(BBA＿09174)于應(yīng)答棉鈴蟲和豆青蟲表皮相比,在對家蠶表皮的應(yīng)答時均表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)。該類蛋白與研究報道較多的球孢白僵菌細(xì)胞壁蛋白有所區(qū)別,其結(jié)構(gòu)和功能都鮮有報道。本研究以該蛋白基因為試驗對象,進(jìn)行了基因的克隆及生物信息...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 昆蟲病原真菌及球孢白僵菌概述
        1.1.1 昆蟲病原真菌概況
        1.1.2 球孢白僵菌簡介
        1.1.3 球孢白僵菌的研究意義
        1.1.4 球孢白僵菌基因功能研究的主要方法
    1.2 球孢白僵菌致病機(jī)理與毒力因子
        1.2.1 致病機(jī)制
        1.2.2 致病過程
        1.2.3 致病因子
    1.3 細(xì)胞表面蛋白
        1.3.1 細(xì)胞表面
        1.3.2 細(xì)胞壁蛋白
        1.3.3 質(zhì)膜表面蛋白
第2章 引言
    2.1 研究背景和意義
    2.2 研究依據(jù)和目的
    2.3 研究內(nèi)容
        2.3.1 Bbcsp1生物信息學(xué)分析
        2.3.2 Bbcsp1基因敲除
        2.3.3 Bbcsp1超量表達(dá)
        2.3.4 Bbcsp1對生物學(xué)表型和毒力的影響
    2.4 研究路線
第3章 球孢白僵菌Bbcsp1基因的克隆及其生物信息學(xué)分析
    3.1 實驗材料與方法
        3.1.1 實驗菌株
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 試劑和培養(yǎng)基配制
        3.1.4 實驗儀器
        3.1.5 實驗分析所涉及的網(wǎng)站及網(wǎng)址
    3.2 實驗方法
        3.2.1 球孢白僵菌基因組DNA的提取
        3.2.2 獲得目的基因序列
        3.2.3 生物信息學(xué)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 Bbcsp1基因的克隆
        3.3.2 Bbcsp1基因的同源性分析
        3.3.3 Bbcsp1基因的氨基酸序列分析
        3.3.4 Bbcsp1蛋白結(jié)構(gòu)域
    3.4 本章小結(jié)
第4章 Bbcsp1基因敲除與超量表達(dá)菌株的構(gòu)建
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株與載體
        4.1.2 工具酶和試劑
        4.1.3 主要試劑和培養(yǎng)基配方
        4.1.4 主要儀器
    4.2 敲除載體的構(gòu)建
        4.2.1 基因上下游片段的克隆
        4.2.2 基因上游片段與敲除載體骨架連接
        4.2.3 基因下游片段與敲除載體骨架連接
    4.3 超量表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.1 強啟動子g3pd和 Bbcsp1-orf片段的克隆
        4.3.2 兩基因片段與超量表達(dá)骨架載體連接
    4.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化球孢白僵菌
        4.4.1 基因敲除載體和超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        4.4.2 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化球孢白僵菌
        4.4.3 轉(zhuǎn)化子的初步篩選
    4.5 獲得敲除突變株
        4.5.1 轉(zhuǎn)化子的PCR篩選
        4.5.2 轉(zhuǎn)化子的RT-PCR驗證
    4.6 獲得超量表達(dá)突變株
        4.6.1 轉(zhuǎn)化子PCR和 PT-PCR檢驗
        4.6.2 轉(zhuǎn)化子q PT-PCR檢測
    4.7 實驗結(jié)果
        4.7.1 側(cè)翼序列的克隆
        4.7.2 敲除載體的構(gòu)建與驗證
        4.7.3 強啟動子和Bbcsp1-orf的克隆
        4.7.4 超量表達(dá)載體的構(gòu)建與驗證
        4.7.5 敲除突變株的驗證
        4.7.6 超量表達(dá)突變株的驗證
    4.8 小結(jié)與討論
第5章 Bbcsp1突變株與野生株生物學(xué)表型和毒力的比較
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗菌株及試驗昆蟲
        5.1.2 實驗試劑和培養(yǎng)基
    5.2 實驗方法
        5.2.1 菌落表型差異觀察及生長速度測定
        5.2.2 分生孢子萌發(fā)率(孢子活力)測定
        5.2.3 不同化學(xué)脅迫因子對生長的影響分析
        5.2.4 濕熱對生長的影響分析
        5.2.5 毒力測定
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 Bbcsp1基因?qū)湫螒B(tài)和生長速率的影響
        5.3.2 Bbcsp1基因?qū)Ψ稚咦踊钚缘挠绊?br>        5.3.3 Bbcsp1基因?qū)鼓婢撤磻?yīng)的影響
        5.3.4 Bbcsp1基因?qū)節(jié)駸岱磻?yīng)的影響
        5.3.5 Bbcsp1基因?qū)Π捉┚玖Φ挠绊?br>    5.4 本章小結(jié)
第6章 全文總結(jié)與討論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
發(fā)表論文及參加的科研項目



本文編號：3781509