IAA2(Indole Acetic Acid 2)是擬南芥Aux/IAA生長素響應(yīng)基因大家族中的一員,目前還沒有它的突變體的報(bào)道,阻礙了對(duì)其功能和作用機(jī)制的深入研究。在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)中,1個(gè)sgRNA只能靶向基因的1個(gè)位點(diǎn),有時(shí)基因敲除的效率并不高。為了提高敲除效率,本文在Golden-Gate克隆技術(shù)的基礎(chǔ)上,通過兩輪PCR擴(kuò)增,將每3個(gè)sgRNA串聯(lián)到同1個(gè)入門載體中,再將入門載體與含Cas9表達(dá)框的目標(biāo)載體LR反應(yīng),獲得最終的表達(dá)載體。結(jié)果表明,設(shè)計(jì)的6個(gè)sgRNA有4個(gè)發(fā)揮了作用,產(chǎn)生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變。與單個(gè)sgRNA相比,多重sgRNA的基因敲除效率高、種系突變多;與其他構(gòu)建多重sgRNA載體的方法相比,本方法具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。本文所得到的5個(gè)突變體為后續(xù)的IAA2功能研究提供了良好的材料。

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本文編號(hào)：3760555