剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲,可以感染幾乎所有的溫血動物,引起嚴重的弓形蟲病癥,造成新生兒流產(chǎn)、死胎等。弱毒活疫苗對控制弓形蟲的傳播有潛在價值,但報道甚少。MORN基因家族因參與速殖子細胞骨架的形成過程而發(fā)揮重要作用,是作為研制抗弓形蟲弱毒活疫苗的理想候選基因。本研究的目的在于構(gòu)建弓形蟲MORN1與MORN2基因缺失株,闡明MORN基因家族成員的在弓形蟲中的生物學功能,評價它們作為弱毒活疫苗的免疫保護力,探究其作為弱毒活疫苗的潛在價值。首先,為研究MORN2基因的生物學功能是否與弓形蟲的毒力相關(guān),我們利用CRISPR/Cas9技術(shù),對弓形蟲I型RH蟲株的MORN2基因進行了敲除。利用同源重組,在基因缺失處插入乙胺嘧啶藥物抗性的片段DHFR。通過單克隆篩選以及PCR鑒定,成功獲得MORN2基因缺失株。對該缺失株進行體外噬斑試驗和體內(nèi)毒力試驗后,發(fā)現(xiàn)MORN2基因的缺失幾乎不影響RH蟲株在體外培養(yǎng)時的生長速度和對小鼠感染的毒力。因此我們認為MORN2基因的缺失不影響弓形蟲RH蟲株的毒力,其缺失株不具備成為弱毒疫苗的可能性。然后,為了研究ΔMORN...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 弓形蟲及弓形蟲病簡述
        1.1.1 病原體
        1.1.2 生活史及傳播
        1.1.3 弓形蟲病及流行
    1.2 CRISPR-Cas9介導的弓形蟲基因編輯技術(shù)
        1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡介
        1.2.2 應(yīng)用于弓形蟲的基因篩選標記
        1.2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在弓形蟲中的應(yīng)用
    1.3 弓形蟲疫苗的研究進展
        1.3.1 傳統(tǒng)疫苗研究
        1.3.2 基于毒力基因敲除的弱毒疫苗
    1.4 弓形蟲MORN基因的研究進展
    1.5 本研究的目的與意義
第二章 弓形蟲MORN2基因缺失株的構(gòu)建及表型研究
    2.1 材料方法
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 蟲株與細胞
        2.1.3 試劑與儀器
        2.1.4 主要溶液的配置
        2.1.5 MORN2基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
        2.1.6 MORN2基因同源臂的構(gòu)建
        2.1.7 電轉(zhuǎn)染弓形蟲速殖子
        2.1.8 陽性單克隆的篩選
        2.1.9 噬斑試驗
        2.1.10 小鼠體內(nèi)毒力試驗
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 MORN2靶向的CRISPR/Cas9質(zhì)粒
        2.2.2 DHFR抗性的MORN2同源片段
        2.2.3 陽性單克隆株的篩選
        2.2.4 噬斑試驗
        2.2.5 小鼠毒力試驗
    2.3 討論
第三章 弓形蟲MORN1基因缺失株的構(gòu)建及免疫保護力評價
    3.1 材料方法
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 蟲株與細胞
        3.1.3 主要溶液的配制
        3.1.4 MORN1基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
        3.1.5 MORN1同源臂的構(gòu)建
        3.1.6 電轉(zhuǎn)染弓形蟲速殖子
        3.1.7 陽性克隆的篩選
        3.1.8 單克隆株的免疫熒光鑒定
        3.1.9 免疫效果評價
        3.1.10 統(tǒng)計學分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 MORN1靶向的CRISPR/Cas9質(zhì)粒
        3.2.2 DHFR抗性的MORN1同源片段
        3.2.3 陽性克隆的篩選
        3.2.4 單克隆株的免疫熒光鑒定
        3.2.5 ΔMORN1缺失株毒力檢測
        3.2.6 免疫鼠Ig G、Ig G1及Ig G2a抗體水平
        3.2.7 免疫鼠淋巴細胞增殖能力
        3.2.8 免疫鼠細胞因子水平
        3.2.9 RH、PYS、Tg C7株的急性感染
        3.2.10 Ⅱ型PRU株的慢性感染
        3.2.11 先天性感染試驗
    3.3 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3753241