TBC結(jié)構(gòu)域蛋白家族是一類真核生物中普遍存在、保守性高、GTP酶激活蛋白。在人類基因組預(yù)測編碼中大約有40多種TBC結(jié)構(gòu)域蛋白成員。TBC家族蛋白結(jié)構(gòu)中具有大約200氨基酸殘基組成的保守性蛋白結(jié)構(gòu)域,包括一個GTPase激活活性結(jié)構(gòu),可以特異性識別RAB-GTP形式將其水解為GDP形式;其結(jié)構(gòu)域還與細(xì)胞膜功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域串聯(lián)在一起組成蛋白質(zhì),如PTB(phosphotyrosine-binding domain)、PH(pleckstrin homology domain)、CC(coiled-coil)或者GRAM(gucosyl transferases)結(jié)構(gòu)域等,其生物學(xué)功能與細(xì)胞膜緊密相關(guān)。該蛋白家族已發(fā)現(xiàn)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。盡管該家族中部分成員其功能和作用靶標(biāo)蛋白有所研究,但是與骨質(zhì)疏松癥和兒童期崩解性疾病(CDD)相關(guān)TBC1D8B作為TBC結(jié)構(gòu)域家族蛋白之一,對其功能和作用靶標(biāo)都有待于研究�；谝陨涎芯勘尘�,本文利用生物信息學(xué)分析、以及形態(tài)學(xué)研究、蛋白共定位、酵母雙雜交等一系列功能實驗,對TBCLD8B的功能及其作用機制進(jìn)行探究,本文研究的主要結(jié)果包括:1.TBC1...

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 緒論
    1. TBC結(jié)構(gòu)域蛋白家族
        1.1 TBC結(jié)構(gòu)域蛋白家族簡介
        1.2 TBC結(jié)構(gòu)域蛋白家族結(jié)構(gòu)特征
    2. TBC結(jié)構(gòu)域蛋白家族與疾病
    3. Rab蛋白
    4. 本文研究的主要內(nèi)容和主要貢獻(xiàn)
第二章 TBC1D8B會影響線粒體的分布及在突觸的運輸
    1. 前言
    2. 實驗材料
        2.1 實驗菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
            2.1.1 實驗菌株
            2.1.2 實驗細(xì)胞株
            2.1.3 質(zhì)粒
        2.2 常用的培養(yǎng)基與緩沖液配方
        2.3 主要儀器設(shè)備
        2.4 主要試劑和試劑盒
    3. 實驗方法
        3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代和凍存
            3.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            3.1.2 細(xì)胞傳代
            3.1.3 細(xì)胞凍存
        3.2 RNA的提取和CDNA的獲取
            3.2.1 RNA提取
            3.2.2 反轉(zhuǎn)錄
        3.3 載體的構(gòu)建
        3.4 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取
        3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.6 Mito染色封片
        3.7 免疫熒光
    4. 實驗結(jié)果
        4.1 TBC1D8B可以部分定位帶線粒體上
            4.1.1 TBC1D8B-pEGFP-N2質(zhì)粒構(gòu)建
            4.1.2 TBC1D8B-pEGFP-N2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染和線粒體染色
        4.2 TBC1D8B會影響線粒體的分布和運輸
    5. 本章小結(jié)
第三章 與TBC1D8B的RAB底物和互作蛋白的篩選
    1. 研究目的
    2. 實驗材料
        2.1 實驗菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
            2.1.1 實驗菌株
            2.1.2 實驗細(xì)胞株
            2.1.3 質(zhì)粒
        2.2 常用的培養(yǎng)基與緩沖液配方
        2.3 主要儀器設(shè)備
        2.4 主要試劑和試劑盒
    3. 實驗方法
        3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代和凍存
        3.2 載體的構(gòu)建
        3.3 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取
        3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.5 點突變
        3.6 酵母雙雜交
    4. 實驗結(jié)果
        4.1 共定位載體的構(gòu)建
        4.2 熒光共定位
        4.3 酵母雙雜交
    5. 本章小結(jié)
第四章 TBC1D8B過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和浸潤能力
    1. 研究目的
    2. 實驗材料
        2.1 實驗菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
        2.2 常用的培養(yǎng)基與緩沖液配方
        2.3 主要儀器設(shè)備
        2.4 主要試劑和試劑盒
    3. 實驗方法
        3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代和凍存
        3.2 載體的構(gòu)建
        3.3 TBC1D8B-pCMV-Tag3C穩(wěn)定表達(dá)株的篩選
            3.3.1 確定單克隆篩選的G418濃度
            3.3.2 穩(wěn)定表達(dá)株的篩選
        3.4. 蛋白的提取和Western Blot
        3.5 酵母雙雜交
        3.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖
        3.7 劃痕愈合實驗
        3.8 Transwell實驗
    4. 實驗結(jié)果
        4.1 異常RHOT1和RHOT2轉(zhuǎn)錄本
        4.2 TBC1D8B過表達(dá)影響細(xì)胞形態(tài)
            4.2.1 TBC1D8B-pCMV-Tag3C載體的構(gòu)建
            4.2.2 TBC1D8B過表達(dá)株的篩選
        4.3 TBC1D8B過表達(dá)使細(xì)胞增殖速度加快
        4.4 TBC1D8B過表達(dá)會影響細(xì)胞的遷移和浸潤
    5. 本章小結(jié)
全文總結(jié)與展望
    TBC1D8B過表達(dá)會影響神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及線粒體的運輸
    TBC1D8B過表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞的增殖,遷移和浸潤的能力
附錄一 RHOT1新轉(zhuǎn)錄本與最接近轉(zhuǎn)錄本對比
附錄二 載體圖譜
常用的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫和生物學(xué)資源
    1. 常用文獻(xiàn)資源搜索網(wǎng)站
    2. 常用生物學(xué)資源網(wǎng)站
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3746578