轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是目前我國種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。美國孟山都公司研發(fā)的一代抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體已在我國批準(zhǔn)商業(yè)化種植和應(yīng)用超過20年。MON531^R7569是本實驗室發(fā)現(xiàn)的與MON531轉(zhuǎn)化體具有相同旁側(cè)序列但cry1Ac基因發(fā)生截短的轉(zhuǎn)基因棉花材料。本研究驗證了MON531^R7569的分子結(jié)構(gòu),建立了其檢測方法,分析了截短cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平,初步分析了cry1Ac基因的甲基化情況,主要結(jié)果有以下五個方面:1:采用PCR方法驗證了MON531^R7569的外源整合結(jié)構(gòu),并建立了MON531^R7569的特異性定量PCR檢測方法。結(jié)果表明:MON531^R7569的轉(zhuǎn)基因整合結(jié)構(gòu)與MON531整合結(jié)構(gòu)相同,但cry1Ac基因3,端序列及終止子區(qū)域發(fā)生缺失�；赾ry1Ac基因重組區(qū)域建立了定量檢測方法,對476份市場轉(zhuǎn)基因棉花的定量分析表明:有4份樣品檢出MON531^R7569,含量最高為1.56%。2:利用RACE和RT-PCR方法分析了MO...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀
        1.1.1 全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀
        1.1.2 我國轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)展現(xiàn)狀
    1.2 轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管及標(biāo)識制度
    1.3 轉(zhuǎn)基因作物檢測技術(shù)發(fā)展
        1.3.1 轉(zhuǎn)基因作物外源核酸的PCR檢測技術(shù)
            1.3.1.1 轉(zhuǎn)基因外源核酸PCR檢測技術(shù)的發(fā)展
            1.3.1.2 常用的轉(zhuǎn)基因PCR檢測技術(shù)
        1.3.2 轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白檢測技術(shù)及其他檢測技術(shù)
    1.4 轉(zhuǎn)基因整合特點
    1.5 轉(zhuǎn)基因植物分子特征
    1.6 轉(zhuǎn)基因作物中殺蟲蛋白的表達(dá)及其影響因素
        1.6.1 轉(zhuǎn)基因棉花殺蟲基因表達(dá)的研究
        1.6.2 其他轉(zhuǎn)基因作物中抗蟲基因的表達(dá)研究
        1.6.3 影響轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白表達(dá)的因素
    1.7 研究背景、內(nèi)容及意義
        1.7.1 研究背景
        1.7.2 研究內(nèi)容
        1.7.3 研究意義
第二章 MON531^R7569插入結(jié)構(gòu)驗證及檢測方法的建立
    2.1 實驗試劑及儀器
    2.2 樣品制備
        2.2.1 材料來源
        2.2.2 基因組DNA提取
    2.3 引物設(shè)計
        2.3.1 結(jié)構(gòu)驗證引物設(shè)計
        2.3.2 外源整合結(jié)構(gòu)驗證引物設(shè)計
        2.3.3 定量檢測方法的引物設(shè)計
    2.4 PCR擴增
        2.4.1 MON531^R7569的旁側(cè)序列及cry1Ac基因的擴增
        2.4.2 MON531^R7569的外源插入結(jié)構(gòu)的擴增
        2.4.3 定量PCR
            2.4.3.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.4.3.2 定量PCR擴增
            2.4.3.3 MON531^R7569市場樣品的定量檢測
    2.5 結(jié)果與分析
        2.5.1 MON531^R7569中旁側(cè)序列和cry1Ac基因驗證結(jié)果
        2.5.2 MON531^R7569外源插入結(jié)構(gòu)的驗證
        2.5.3 定量檢測方法的建立及應(yīng)用
            2.5.3.1 定量PCR方法的建立
            2.5.3.2 市場樣品的定量檢測
    2.6 討論與分析
第三章 MON531^R7569中cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄分析
    3.1 主要試劑及儀器
    3.2 樣品制備及RNA提取
        3.2.1 材料來源
        3.2.2 總RNA提取
    3.3 RACE分析
        3.3.1 RACE引物設(shè)計
        3.3.2 RACEReadycDNA的合成
        3.3.3 巢式PCR擴增
        3.3.4 PCR產(chǎn)物克隆測序
            3.3.4.1 產(chǎn)物回收
            3.3.4.2 連接載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            3.3.4.3 配置LB液體和固態(tài)平板培養(yǎng)基
            3.3.4.4 涂板及擴繁
            3.3.4.5 菌液PCR鑒定及測序
    3.4 RT-PCR
        3.4.1 RT-PCR引物設(shè)計
        3.4.2 cDNA的合成
        3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.4.4 RT-PCR
        3.4.5 RT-PCR數(shù)據(jù)處理
    3.5 結(jié)果分析
        3.5.1 MON531^R7569的cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄本分析
            3.5.1.1 巢式PCR
            3.5.1.2 PCR產(chǎn)物克隆測序
            3.5.1.3 cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄本分析
        3.5.2 MON531^R7569的cry1Ac基因轉(zhuǎn)錄分析
            3.5.2.1 cry1Ac基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線
            3.5.2.2 轉(zhuǎn)錄水平分析
    3.6 結(jié)論與討論
第四章 MON531^R7569中Cry1Ac蛋白的表達(dá)分析
    4.1 實驗試劑與儀器
    4.2 樣品制備
        4.2.1 材料來源
        4.2.2 植物總蛋白的提取
    4.3 Cry1Ac蛋白含量測定
    4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析
    4.5 結(jié)果分析
    4.6 結(jié)論與討論
第五章 轉(zhuǎn)基因棉花MON531^R7569室內(nèi)抗蟲性測定
    5.1 實驗試劑及儀器
    5.2 材料準(zhǔn)備
        5.2.1 棉花樣品來源
        5.2.2 供試蟲源
    5.3 生物測定
    5.4 殺蟲蛋白含量測定
    5.5 數(shù)據(jù)處理
    5.6 結(jié)果分析
        5.6.1 棉鈴蟲取食棉花葉片情況
        5.6.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲性測定
        5.6.3 Cry1Ac殺蟲蛋白含量測定
    5.7 結(jié)論與討論
第六章 cry1Ac基因序列的甲基化分析
    6.1 主要試劑及儀器
    6.2 樣品制備
        6.2.1 材料來源
        6.2.2 基因組DNA提取
    6.3 引物設(shè)計
        6.3.1 MON531^R7569的cry1Ac基因MSRE-qPCR引物設(shè)計
        6.3.2 亞硫酸鹽測序法的PCR引物設(shè)計
    6.4 cry1Ac基因的MSRE-qPCR
        6.4.1 甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的選擇
        6.4.2 酶切基因組DNA
        6.4.3 RT-PCR
    6.5 亞硫酸鹽測序分析甲基化區(qū)域
        6.5.1 基因組DNA的亞硫酸鹽處理
        6.5.2 PCR擴增
        6.5.3 產(chǎn)物克隆測序
    6.6 數(shù)據(jù)處理
        6.6.1 cry1Ac基因甲基化區(qū)域定量分析
    6.7 結(jié)果分析
        6.7.1 MON531^R7569的cry1Ac基因的甲基化測定
        6.7.2 cry1Ac基因序列甲基化區(qū)域不同時期的監(jiān)測
        6.7.3 cry1Ac基因甲基化序列區(qū)域亞硫酸鹽測序
    6.8 結(jié)論與討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3746418