轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是目前我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。美國(guó)孟山都公司研發(fā)的一代抗蟲(chóng)棉MON531轉(zhuǎn)化體已在我國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)化種植和應(yīng)用超過(guò)20年。MON531^R7569是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的與MON531轉(zhuǎn)化體具有相同旁側(cè)序列但cry1Ac基因發(fā)生截短的轉(zhuǎn)基因棉花材料。本研究驗(yàn)證了MON531^R7569的分子結(jié)構(gòu),建立了其檢測(cè)方法,分析了截短cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平,初步分析了cry1Ac基因的甲基化情況,主要結(jié)果有以下五個(gè)方面:1:采用PCR方法驗(yàn)證了MON531^R7569的外源整合結(jié)構(gòu),并建立了MON531^R7569的特異性定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明:MON531^R7569的轉(zhuǎn)基因整合結(jié)構(gòu)與MON531整合結(jié)構(gòu)相同,但cry1Ac基因3,端序列及終止子區(qū)域發(fā)生缺失�；赾ry1Ac基因重組區(qū)域建立了定量檢測(cè)方法,對(duì)476份市場(chǎng)轉(zhuǎn)基因棉花的定量分析表明:有4份樣品檢出MON531^R7569,含量最高為1.56%。2:利用RACE和RT-PCR方法分析了MO...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀
        1.1.1 全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀
        1.1.2 我國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)展現(xiàn)狀
    1.2 轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管及標(biāo)識(shí)制度
    1.3 轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)技術(shù)發(fā)展
        1.3.1 轉(zhuǎn)基因作物外源核酸的PCR檢測(cè)技術(shù)
            1.3.1.1 轉(zhuǎn)基因外源核酸PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展
            1.3.1.2 常用的轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)技術(shù)
        1.3.2 轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白檢測(cè)技術(shù)及其他檢測(cè)技術(shù)
    1.4 轉(zhuǎn)基因整合特點(diǎn)
    1.5 轉(zhuǎn)基因植物分子特征
    1.6 轉(zhuǎn)基因作物中殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)及其影響因素
        1.6.1 轉(zhuǎn)基因棉花殺蟲(chóng)基因表達(dá)的研究
        1.6.2 其他轉(zhuǎn)基因作物中抗蟲(chóng)基因的表達(dá)研究
        1.6.3 影響轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白表達(dá)的因素
    1.7 研究背景、內(nèi)容及意義
        1.7.1 研究背景
        1.7.2 研究?jī)?nèi)容
        1.7.3 研究意義
第二章 MON531^R7569插入結(jié)構(gòu)驗(yàn)證及檢測(cè)方法的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
    2.2 樣品制備
        2.2.1 材料來(lái)源
        2.2.2 基因組DNA提取
    2.3 引物設(shè)計(jì)
        2.3.1 結(jié)構(gòu)驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)
        2.3.2 外源整合結(jié)構(gòu)驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)
        2.3.3 定量檢測(cè)方法的引物設(shè)計(jì)
    2.4 PCR擴(kuò)增
        2.4.1 MON531^R7569的旁側(cè)序列及cry1Ac基因的擴(kuò)增
        2.4.2 MON531^R7569的外源插入結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增
        2.4.3 定量PCR
            2.4.3.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.4.3.2 定量PCR擴(kuò)增
            2.4.3.3 MON531^R7569市場(chǎng)樣品的定量檢測(cè)
    2.5 結(jié)果與分析
        2.5.1 MON531^R7569中旁側(cè)序列和cry1Ac基因驗(yàn)證結(jié)果
        2.5.2 MON531^R7569外源插入結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證
        2.5.3 定量檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
            2.5.3.1 定量PCR方法的建立
            2.5.3.2 市場(chǎng)樣品的定量檢測(cè)
    2.6 討論與分析
第三章 MON531^R7569中cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄分析
    3.1 主要試劑及儀器
    3.2 樣品制備及RNA提取
        3.2.1 材料來(lái)源
        3.2.2 總RNA提取
    3.3 RACE分析
        3.3.1 RACE引物設(shè)計(jì)
        3.3.2 RACEReadycDNA的合成
        3.3.3 巢式PCR擴(kuò)增
        3.3.4 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序
            3.3.4.1 產(chǎn)物回收
            3.3.4.2 連接載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            3.3.4.3 配置LB液體和固態(tài)平板培養(yǎng)基
            3.3.4.4 涂板及擴(kuò)繁
            3.3.4.5 菌液PCR鑒定及測(cè)序
    3.4 RT-PCR
        3.4.1 RT-PCR引物設(shè)計(jì)
        3.4.2 cDNA的合成
        3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.4.4 RT-PCR
        3.4.5 RT-PCR數(shù)據(jù)處理
    3.5 結(jié)果分析
        3.5.1 MON531^R7569的cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄本分析
            3.5.1.1 巢式PCR
            3.5.1.2 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序
            3.5.1.3 cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄本分析
        3.5.2 MON531^R7569的cry1Ac基因轉(zhuǎn)錄分析
            3.5.2.1 cry1Ac基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線
            3.5.2.2 轉(zhuǎn)錄水平分析
    3.6 結(jié)論與討論
第四章 MON531^R7569中Cry1Ac蛋白的表達(dá)分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
    4.2 樣品制備
        4.2.1 材料來(lái)源
        4.2.2 植物總蛋白的提取
    4.3 Cry1Ac蛋白含量測(cè)定
    4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析
    4.5 結(jié)果分析
    4.6 結(jié)論與討論
第五章 轉(zhuǎn)基因棉花MON531^R7569室內(nèi)抗蟲(chóng)性測(cè)定
    5.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
    5.2 材料準(zhǔn)備
        5.2.1 棉花樣品來(lái)源
        5.2.2 供試蟲(chóng)源
    5.3 生物測(cè)定
    5.4 殺蟲(chóng)蛋白含量測(cè)定
    5.5 數(shù)據(jù)處理
    5.6 結(jié)果分析
        5.6.1 棉鈴蟲(chóng)取食棉花葉片情況
        5.6.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)性測(cè)定
        5.6.3 Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白含量測(cè)定
    5.7 結(jié)論與討論
第六章 cry1Ac基因序列的甲基化分析
    6.1 主要試劑及儀器
    6.2 樣品制備
        6.2.1 材料來(lái)源
        6.2.2 基因組DNA提取
    6.3 引物設(shè)計(jì)
        6.3.1 MON531^R7569的cry1Ac基因MSRE-qPCR引物設(shè)計(jì)
        6.3.2 亞硫酸鹽測(cè)序法的PCR引物設(shè)計(jì)
    6.4 cry1Ac基因的MSRE-qPCR
        6.4.1 甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的選擇
        6.4.2 酶切基因組DNA
        6.4.3 RT-PCR
    6.5 亞硫酸鹽測(cè)序分析甲基化區(qū)域
        6.5.1 基因組DNA的亞硫酸鹽處理
        6.5.2 PCR擴(kuò)增
        6.5.3 產(chǎn)物克隆測(cè)序
    6.6 數(shù)據(jù)處理
        6.6.1 cry1Ac基因甲基化區(qū)域定量分析
    6.7 結(jié)果分析
        6.7.1 MON531^R7569的cry1Ac基因的甲基化測(cè)定
        6.7.2 cry1Ac基因序列甲基化區(qū)域不同時(shí)期的監(jiān)測(cè)
        6.7.3 cry1Ac基因甲基化序列區(qū)域亞硫酸鹽測(cè)序
    6.8 結(jié)論與討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3746418