發(fā)布時間：2023-01-03 10:12

　　枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種重要的革蘭氏陽性菌,多年來一直作為模式微生物使用。隨著全基因組測序的完成、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等多組學(xué)分析的不斷深入,B.subtilis已經(jīng)成為代謝工程、重組蛋白表達(dá)和復(fù)雜遺傳線路等研究的理想底盤微生物。目前在枯草芽孢桿菌中利用合成生物學(xué)構(gòu)建表達(dá)模塊已成為研究熱點。人工基因表達(dá)元件是設(shè)計表達(dá)模塊、構(gòu)建基因電路的基礎(chǔ)。目前,在枯草芽孢桿菌中已有多種不同類型的人工啟動子廣泛應(yīng)用到基因電路中,而諸多其他類型的元件,如存在于非編碼區(qū)的終止子和調(diào)控序列等尚未充分挖掘、開發(fā),且元件在枯草芽孢桿菌中對外源基因的調(diào)控規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)研究。這些問題阻礙了構(gòu)建大規(guī)模復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展,極大制約了枯草芽孢桿菌合成生物技術(shù)的推進(jìn)。基于此,本論文分別研究了存在于枯草芽孢桿菌中3’非編碼區(qū)的終止子和5’非編碼區(qū)的調(diào)控序列對異源基因表達(dá)的作用,并且通過合成生物學(xué)技術(shù)對這兩種調(diào)控序列進(jìn)行改造,提升了外源基因的表達(dá)效率,研究取得的具體研究結(jié)果如下:（1）B.subtilis中高效終止子的鑒定及分子改造。以GFP和mCherry為報告基因,構(gòu)建了基于雙熒光信號的終止... 

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 合成生物學(xué)在枯草芽孢桿菌中研究進(jìn)展
        1.1.1 合成生物學(xué)概述
        1.1.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)
        1.1.3 影響枯草芽孢桿菌中蛋白表達(dá)的因素分析
    1.2 原核生物表達(dá)的調(diào)控元件
        1.2.1 啟動子
        1.2.2 核糖體結(jié)合位點
        1.2.3 終止子——3’非編碼區(qū)RNA調(diào)控元件
        1.2.4 調(diào)控RNA元件——5’非編碼區(qū)調(diào)控元件
        1.2.5 影響mRNA穩(wěn)定性的5’-UTR特征
        1.2.6 RNA調(diào)控元件在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中的優(yōu)勢
    1.3 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的概述及應(yīng)用
        1.3.1 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的簡介
        1.3.2 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的應(yīng)用
    1.4 課題研究的意義與內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要溶液
    2.2 DNA操作
        2.2.1 質(zhì)粒的提取
        2.2.2 引物的設(shè)計
        2.2.3 基因擴(kuò)增
        2.2.4 DNA的檢測和回收
        2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        2.2.7 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化
    2.3 終止子重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.1 終止子測試質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 單終止子的構(gòu)建
        2.3.3 雙串聯(lián)終止子的構(gòu)建
        2.3.4 三串聯(lián)終止子的構(gòu)建
    2.4 L-天冬氨酸-α-脫羧酶重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.1 L-天冬氨酸-α-脫羧酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.2 L-天冬氨酸-α-脫羧酶C末端融合sfGFP質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.3 L-天冬氨酸-α-脫羧酶N末端融合sfGFP質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.4 N端截短突變體的構(gòu)建
        2.4.5 融合肽精簡突變體的構(gòu)建
    2.5 分析方法
        2.5.1 綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白mCherry熒光水平的檢測
        2.5.2 終止效率的測定方法
        2.5.3 重組蛋白表達(dá)水平的檢測
        2.5.4 PanD酶活水平的檢測
        2.5.5 熒光定量PCR
        2.5.6 統(tǒng)計分析
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 終止子在枯草芽孢桿菌中對異源基因表達(dá)的調(diào)控及分子改造
        3.1.1 終止子篩選平臺的建立
        3.1.2 終止子終止效率的鑒定
        3.1.3 終止子TB5 與大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)化強終止子rrnBT1 性能比較
        3.1.4 串聯(lián)終止子的構(gòu)建及表征
    3.2 mRNA5’非編碼區(qū)對異源蛋白表達(dá)的抑制機(jī)制和消除策略
        3.2.1 赤擬谷盜L-天冬氨酸-α-脫羧酶在B.subtilis中表達(dá)抑制效應(yīng)的鑒定
        3.2.2 panD基因mRNA5’端二級結(jié)構(gòu)對重組蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用
        3.2.3 利用N端融合策略消除PanD翻譯抑制
        3.2.4 融合肽長度精簡及篩選
        3.2.5 PanD不同融合形式及突變體基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測
主要結(jié)論與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]β-丙氨酸的生理功能及其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 齊博,武書庚,王晶,齊廣海,張海軍.  動物營養(yǎng)學(xué)報. 2016(04)
[2]β-氨基丙酸的合成與應(yīng)用[J]. 羅積杏,薛建萍,沈寅初.  氨基酸和生物資源. 2005(01)
[3]苯基異硫氰酸酯衍生氨基酸的高效液相色譜分析[J]. 楊揚，秦強，郭偉忠.  色譜. 1994(04)



本文編號：3727273