維管植物的維管束（vascular bundle）是植物體最主要的輸導組織,其形成與發(fā)育是一個受多種基因和調(diào)控途徑共同作用的生化過程。本實驗室從煙草中克隆了一個在維管束中特異表達的新基因sm-Nvas。為了初步分析其功能,利用CaMV35S為啟動子,與sm-Nvas全基因序列和GUS相連接形成融合基因,構建了表達載體CaMV35S::sm-Nvas::GUS,并遺傳轉化,獲得轉基因陽性植株,表現(xiàn)出矮化、莖和葉脈增粗、維管束列數(shù)增多、維管束薄壁細胞的長度縮短等特征。因此,初步認為sm-Nvas與維管束發(fā)育相關。本實驗完成的主要內(nèi)容包括以下兩個方面:（1）在此基礎上,為了進一步探討該基因的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對煙草維管束發(fā)育相關基因sm-Nvas中的兩段序列進行敲除,并成功構建了pc1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體,將構建好的敲除載體電激轉化農(nóng)桿菌并侵染煙草葉盤,完成遺傳轉化和轉基因植株的陽性鑒定及基因編輯分析,對陽性植株和野生型植株進行對比觀察,進一步確定該基因在維管束生長發(fā)育過程中所起到的作用。（2）本研究還構建了pMAL-p5x-sm... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 維管束及其發(fā)育調(diào)控
        1.1.1 維管束簡介
        1.1.2 維管束的發(fā)育調(diào)控
    1.2 基因編輯技術的發(fā)展與應用
        1.2.1 基因編輯技術的發(fā)展
        1.2.2 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的結構和作用
        1.2.3 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的應用
    1.3 pMAL原核表達載體的功能與應用
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的構建及遺傳轉化
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 煙草品種
        2.2.2 菌株及載體
        2.2.3 主要試劑及配方
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的構建
        2.3.2 陽性克隆電激轉化農(nóng)桿菌
        2.3.3 農(nóng)桿菌介導的pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas煙草遺傳轉化
        2.3.4 轉基因T0代植株的陽性鑒定
        2.3.5 轉基因T0代植株的表型分析及切片觀察
    2.4 結果與分析
        2.4.1 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的構建
        2.4.2 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的遺傳轉化
        2.4.3 轉基因苗的陽性鑒定
        2.4.4 轉基因苗的基因敲除檢測
        2.4.5 轉基因T0代植株的表型分析與切片觀察
    2.5 討論
第三章 sm-Nvas原核表達載體構建及其蛋白純化
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 煙草品種
        3.2.2 載體及菌株
        3.2.3 主要試劑及配方
        3.2.4 主要儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達載體的構建
        3.3.2 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達載體的誘導表達
    3.4 結果與分析
        3.4.1 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達載體的構建
        3.4.2 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達載體的誘導表達
        3.4.3 表達蛋白純化
    3.5 討論
參考文獻
致謝
參與的學術會議


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]水稻ORF216蛋白和煙草SM-NGT1蛋白的原核表達研究[D]. 胡婧.中南民族大學 2010



本文編號：3727082