乳酰谷胱甘肽裂合酶（Lac）是降解生物體內(nèi)丙酮醛的重要酶之一。食品級微生物谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組上的NCgl0106預(yù)測為乳酰谷胱甘肽裂合酶基因,但尚缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出預(yù)測的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032乳酰谷胱甘肽裂合酶基因lac,并將之與表達(dá)載體pET-28a連接,轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞,成功獲得工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-28a-lac。然后,使用IPTG誘導(dǎo)E.coli BL21（DE3）/pET-28a-lac表達(dá)重組蛋白乳酰谷胱甘肽裂合酶。SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明:重組乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白在大腸桿菌進(jìn)行了可溶性表達(dá),其分子量約為14kDa。最后,對重組乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白進(jìn)行了分離純化、活性檢測及酶學(xué)特性分析。應(yīng)用His-tag純化獲得的重組蛋白溶液濃度為604.9μg/mL;活性檢測顯示重組乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白能催化丙酮醛和谷胱甘肽生成S-D-乳酰谷胱甘肽,表明谷氨酸棒桿菌NCgl0106是乳酰谷胱甘肽裂合酶基因;酶學(xué)特性分析表明重組乳酰谷胱甘肽裂合酶的最適反應(yīng)溫度為60℃,最適反應(yīng)pH為7... 

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 谷氨酸棒桿菌簡介
        1.1.1 谷氨酸棒狀桿菌的工業(yè)應(yīng)用
        1.1.2 谷氨酸棒狀桿菌的全基因組鑒定
    1.2 酶的簡介
        1.2.1 乳酰谷胱甘肽裂合酶
        1.2.2 3 -磷酸甘油醛脫氫酶
    1.3 主要研究內(nèi)容及意義
2 材料和方法
    2.1 菌株,質(zhì)粒和生長條件及引物
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物
        2.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑
        2.1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)菌基因組的制備
        2.2.2 質(zhì)粒DNA的制備
        2.2.3 PCR反應(yīng)體系
        2.2.4 質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切、純化和連接
        2.2.5 E.coli化學(xué)轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.6 重組質(zhì)粒的DNA測序
        2.2.7 蛋白質(zhì)SDS-PAGE及 Western Blot印跡分析
    2.3 菌種保藏
    2.4 乳酰谷胱甘肽裂合酶基因的克隆與表達(dá)
        2.4.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-lac
        2.4.2 pET-28a-lac重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.4.3 乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.4 化乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白的純化
        2.4.5 測定純化蛋白質(zhì)的濃度及丙酮醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線
        2.4.6 測定乳酰谷胱甘肽裂合酶活
    2.5 乳酰谷胱甘肽裂合酶的酶學(xué)特征
        2.5.1 測定乳酰谷胱甘肽裂合酶的最適反應(yīng)pH值
        2.5.2 測定乳酰谷胱甘肽裂合酶的最適反應(yīng)溫度
        2.5.3 金屬離子對乳酰谷胱甘肽裂合酶活性的影響
        2.5.4 乳酰谷胱甘肽裂合酶的米氏常數(shù)
    2.6 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆與表達(dá)
        2.6.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-GAPDH
        2.6.2 pET-28a-GAPDH重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.6.3 3 -磷酸甘油醛脫氫酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.6.4 3 -磷酸甘油醛脫氫酶蛋白的純化
        2.6.5 測定純化蛋白質(zhì)的濃度
        2.6.6 測定3-磷酸甘油醛脫氫酶酶活
    2.7 測定3-磷酸甘油醛脫氫酶的酶學(xué)特征
        2.7.1 測定3-磷酸甘油醛脫氫酶的最適反應(yīng)pH值
        2.7.2 測定3-磷酸甘油醛脫氫酶的最適反應(yīng)溫度
        2.7.3 測定金屬離子對3-磷酸甘油醛脫氫酶活性的影響
        2.7.4 測定3-磷酸甘油醛脫氫酶的米氏常數(shù)
3 結(jié)果與分析
    3.1 乳酰谷胱甘肽裂合酶
        3.1.1 PCR擴(kuò)增乳酰谷胱甘肽裂合酶基因
        3.1.2 pET-28a-lac重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.3 乳酰谷胱甘肽裂合酶蛋白濃度及丙酮醛標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
        3.1.4 乳酰谷胱甘肽裂合酶的純化
        3.1.5 不同反應(yīng)pH值、溫度及金屬離子對重組乳酰谷胱甘肽裂合酶Lac活性的影響
        3.1.6 乳酰谷胱甘肽裂合酶的米氏常數(shù)
    3.2 3-磷酸甘油醛脫氫酶
        3.2.1 PCR擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶基因
        3.2.2 pET-28a-GAPDH重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 3-磷酸甘油醛脫氫酶的純化
        3.2.4 3-磷酸甘油醛脫氫酶濃度測定
        3.2.5 不同反應(yīng)pH值、溫度及金屬離子對重組乳酰谷胱甘肽裂合酶Lac活性的影響
        3.2.6 3-磷酸甘油醛脫氫酶的米氏常數(shù)
4 討論和結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡歷
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]辣椒3-磷酸甘油醛脫氫酶基因CaGAPB的克隆及表達(dá)分析[J]. 李嚴(yán)曼,歐陽孟真,孫守如,朱磊.  分子植物育種. 2018(05)
[2]乙二醛酶1在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)[J]. 李錦宏,陳兵,顧雪鋒,馬國達(dá),楊帆,高力揚(yáng),廖壯檳,林亨,龍霄翱.  廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2016(05)
[3]代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生成丙酮酸[J]. 于瑩,許湄雪,劉金雷,范榮,馮惠勇,李天明.  生物技術(shù)通報(bào). 2016(08)
[4]3-磷酸甘油醛脫氫酶在細(xì)菌粘附中的作用及機(jī)制[J]. 劉麗,章文明,王翀,汪海峰.  微生物學(xué)報(bào). 2016(09)
[5]谷胱甘肽雙功能合成酶的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用的研究[J]. 陳斌斌,楊修亮,杭寶建,石禮濤,黃磊,蔡謹(jǐn),徐志南.  藥物生物技術(shù). 2015(05)
[6]乙二醛酶Ⅰ基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系[J]. 廖志敏,符家武,劉根.  中華神經(jīng)科雜志. 2015 (07)
[7]谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L賴氨酸的培養(yǎng)優(yōu)化和產(chǎn)酸特性研究[J]. 蘇會波,林海龍,羅虎,周勇,盧宗梅.  食品工業(yè)科技. 2014(17)
[8]利用蛋白質(zhì)序列模式識別改善谷氨酸棒桿菌基因組注釋[J]. 周大為,李煒疆.  工業(yè)微生物. 2014(03)
[9]白色念珠菌3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆及表達(dá)[J]. 趙珊梅,袁雪巖,石建峰,李昂,苗群愛.  北京口腔醫(yī)學(xué). 2013(05)
[10]3-磷酸甘油醛脫氫酶的分子生物學(xué)功能及其對寄生蟲防治的研究進(jìn)展[J]. 方政.  國外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊). 2013 (02)

碩士論文
[1]乙二醛酶I基因Ala111Glu多態(tài)性與糖尿病合并冠心病的關(guān)系以及人血漿丙酮醛的高效液相色譜測定方法的建立[D]. 金勛.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 2008



本文編號：3716855