蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）是一種桿狀革蘭氏陰性細菌,為腸桿菌科哈夫尼亞菌屬的代表性細菌。因其具有嗜冷、喜好厭氧潮濕環(huán)境等特點,常常成為低溫貯藏食品中的特定腐敗菌（Specific Spoilage Organisms,SSO）。研究表明,其致腐行為受由N-酰基-高絲氨酸內酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）介導的lux型群體感應系統(tǒng)的調控。因此,本文以腐敗大菱鲆中分離純化得到的一株蜂房哈夫尼亞菌Ha-01為研究對象,通過基因工程和生物信息學等技術研究其菌株內的lux型群體感應調控基因halI/R,初步探究二者編碼的HalI/R蛋白的功能性質,并討論二者能否對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的形成起到調控作用。研究旨在探討由群體感應系統(tǒng)調節(jié)的魚類腐敗機制,為建立以靶向控制群體感應系統(tǒng)為基礎的水產(chǎn)品保鮮新技術提供理論依據(jù)。1.根據(jù)GenBank中登錄halI/R基因序列設計特異性擴增全長引物,利用TA克隆技術構建克隆載體pMD-halI和pMD-halR,并導入宿主E.coli JM109中大量擴增;后經(jīng)測序及BLAST比對分析,結果顯示由蜂房哈夫尼亞菌... 

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 群體感應現(xiàn)象
        1.1.1 群體感應的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 群體感應的類型
    1.2 群體感應相關蛋白及其分子機制
        1.2.1 LuxI-type信號分子合成酶
        1.2.2 LuxR-type轉錄因子
        1.2.3 LuxR-type轉錄因子與AHL分子及靶基因的相互作用
    1.3 群體感應與水產(chǎn)品腐敗
        1.3.1 水產(chǎn)品特定腐敗菌
        1.3.2 水產(chǎn)腐敗菌的QS系統(tǒng)
        1.3.3 水產(chǎn)品致腐因子與群體感應
    1.4 研究的主要內容、目的及意義
第二章 大菱鲆源蜂房哈夫尼亞菌群體感應基因的克隆
    2.1 前言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 實驗菌株及培養(yǎng)條件
        2.2.2 質粒與引物
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 菌種活化
        2.3.2 蜂房哈夫尼亞菌Ha-01基因組DNA提取
        2.3.3 引物設計及合成
        2.3.4 蜂房哈夫尼亞菌Ha-01目的基因halI/R的 PCR擴增
        2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3.6 克隆載體的構建
        2.3.7 陽性克隆子的篩選、鑒定與質粒抽提
        2.3.8 克隆載體測序及序列比對
    2.4 結果與討論
        2.4.1 蜂房哈夫尼亞菌Ha-01目的基因halI/R的PCR擴增與產(chǎn)物純化
        2.4.2 陽性轉化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的篩選
        2.4.3 陽性轉化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的鑒定
        2.4.4 陽性克隆質粒pMD-halI,pMD-halR的測序結果
        2.4.5 目的片段的序列比對結果
    2.5 小結
第三章 蜂房哈夫尼亞菌群體感應基因halI/R的生物信息學分析
    3.1 前言
    3.2 實驗材料與分析工具
        3.2.1 halI和halR的核酸序列
        3.2.2 生物信息學分析工具
    3.3 實驗方法
        3.3.1 HalI/R蛋白一級結構的確定
        3.3.2 HalI/R蛋白的序列比對分析
        3.3.3 HalI/R蛋白理化性質的預測
        3.3.4 HalI/R蛋白的功能性預測
        3.3.5 HalI/R蛋白的二級結構預測
        3.3.6 HalI/R蛋白的三維構象預測
        3.3.7 蛋白間的相互作用研究
        3.3.8 蛋白表達系統(tǒng)的選擇
    3.4 結果與討論
        3.4.1 HalI/R蛋白一級結構的確定
        3.4.2 HalI/R蛋白的BLAST分析
        3.4.3 HalI/R蛋白理化性質的預測
        3.4.4 HalI/R蛋白功能預測
        3.4.5 HalI/R蛋白的二級結構預測
        3.4.6 HalI/R蛋白的三維構象模型
        3.4.7 蛋白質交互作用研究
        3.4.8 halI/R基因密碼子偏向性分析
    3.5 小結
第四章 蜂房哈夫尼亞菌群體感應基因halI/R的密碼子優(yōu)化與表達模型構建
    4.1 前言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 實驗菌株與質粒
        4.2.2 引物
        4.2.3 主要試劑
        4.2.4 主要儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 halI/R基因密碼子的優(yōu)化與分析
        4.3.2 表達載體的構建
        4.3.3 陽性質粒轉化表達宿主菌E.coli BL21(DE3)
        4.3.4 陽性菌落pET22-halI-BL21、pET28-halR-BL21 的篩選
        4.3.5 重組蛋白的誘導表達
        4.3.6 重組蛋白表達情況的分析
    4.4 結果與討論
        4.4.1 halI/R基因密碼子的優(yōu)化與分析
        4.4.2 插入片段的獲取
        4.4.3 表達質粒的線性化
        4.4.4 陽性克隆子的篩選與鑒定
        4.4.5 陽性轉化子E.coli BL21(DE3)的篩選
        4.4.6 目的蛋白的誘導表達
        4.4.7 表達情況分析及Western Blotting鑒定
    4.5 小結
第五章 蜂房哈夫尼亞菌HalI/R功能的初步研究
    5.1 前言
    5.2 材料與儀器
        5.2.1 實驗菌株及培養(yǎng)條件
        5.2.2 材料準備
        5.2.3 主要試劑
        5.2.4 主要儀器
    5.3 實驗方法
        5.3.1 生物感應器菌株檢測HalI蛋白合成AHL信號分子的能力
        5.3.2 GC-MS分析HalI蛋白所產(chǎn)信號分子的種類
        5.3.3 GC-MS分析HalR蛋白結合信號分子的能力
        5.3.4 分子對接分析HalR蛋白結合信號分子的作用機理
        5.3.5 HalI蛋白合成產(chǎn)物對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的影響
    5.4 結果與討論
        5.4.1 HalI蛋白合成AHL信號分子的能力
        5.4.2 HalI蛋白合成信號分子的種類
        5.4.3 HalR蛋白結合信號分子的能力分析
        5.4.4 HalI蛋白合成產(chǎn)物對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的影響
    5.5 小結
第六章 總結、創(chuàng)新點及展望
    6.1 總結
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
碩士期間發(fā)表論文情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]冷藏草魚源氣單胞菌的群體感應現(xiàn)象及其對生物膜形成的影響[J]. 張彩麗,王辰晨,朱菲菲,劉海梅,劉巖龍.  食品科學. 2019(22)
[2]擬南芥AtOFP8的生物信息學分析及表達分析[J]. 唐堯,張微,尹艷莉,馮鵬,陳宇峰,常纓.  北方園藝. 2018(18)
[3]環(huán)境條件對蜂房哈夫尼亞菌群體感應信號分子活性及其形成生物被膜能力的影響[J]. 李婷婷,馬艷,崔方超,楊兵,勵建榮.  中國食品學報. 2018(04)
[4]群體感應AHLs對溫和氣單胞菌體外致腐因子分泌的影響[J]. 李婷婷,崔方超,馬艷,勵建榮.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2017(03)
[5]不同培養(yǎng)條件及群體感應信號分子對蜂房哈夫尼亞菌生物被膜的影響[J]. 馬艷,李婷婷,崔方超,勵建榮.  食品科學. 2017(06)
[6]細菌群體感應LuxR solos蛋白研究進展[J]. 葉曉鋒,朱軍莉,汪海峰.  微生物學報. 2017(03)
[7]大菱鲆源蜂房哈夫尼亞菌群體感應現(xiàn)象及生物被膜調控的研究[J]. 馬艷,李婷婷,崔方超,楊兵,劉明爽,勵建榮.  現(xiàn)代食品科技. 2016(08)
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[10]大菱鲆熒光假單胞菌的群體感應現(xiàn)象及不同碳源培養(yǎng)下的腐敗特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,劉明爽,馬燕,勵建榮.  現(xiàn)代食品科技. 2015(12)

博士論文
[1]冷藏凡納濱對蝦特定腐敗菌群體感應現(xiàn)象與致腐能力的研究[D]. 朱素芹.中國海洋大學 2015

碩士論文
[1]大黃魚特定腐敗菌S. baltica信號分子與生物胺消長關系及調控[D]. 馮杰.浙江工商大學 2018
[2]大黃魚腐敗希瓦氏菌群體感應信號分子AHLs對其致腐性的影響及機制研究[D]. 張笑笑.浙江工商大學 2017
[3]凡納濱對蝦特定腐敗菌中AHLs介導的群體感應與調控的初步研究[D]. 郭紅.中國海洋大學 2010



本文編號：3715656