利用基因敲除的實驗動物我們可以直接檢測疾病病理發(fā)生發(fā)展的過程,揭示基因、細胞組織結構與病因癥狀之間的關系。轉基因兔已成為基因功能研究、人類疾病模型建立和高價值藥用蛋白生產(chǎn)的重要工具。小鼠的Rosa26基因座已被廣泛應用于外源基因的定點整合。近年來,關于豬的Rosa26位點也有相關學者進行了研究,并成功培育了轉基因豬。小鼠的第11號染色體上存在一個安全位點,在2010年時該位點被斯坦福大學的研究團隊成功分離并鑒定出來,命名為hipp11位點,簡稱H11位點。該位點位于Drg1基因的9號外顯子和Eif4enif1基因的19號外顯子之間,大小約5kb。由于位于間隔序列中,因此有很高的安全性,不容易被基因沉默,在多種細胞中都可以表達。目的:本研究以家兔為研究對象,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),目的是改進兔遺傳操作體系,建立成熟高效的兔基因敲除平臺,對基因工程兔的推廣應用具有重要意義。為基因功能研究、人類疾病動物模型和高價值蛋白乳腺生物反應器研制提供新手段、新方法。方法:⑴利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)根據(jù)家兔的MSTN基因構建敲除載體,在細胞水平驗證其敲除效率。⑵通過生物信息學鑒定家... 

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
主要符號表
引言
第一章 文獻綜述
    1.1 基因組定點編輯技術
        1.1.1 工程核酸酶精確的編輯基因
        1.1.2 Cas9: RNA介導的基因組編輯
        1.1.3 與其他基因組編輯技術的比較
        1.1.4 Cas9 系統(tǒng)的局限性
    1.2 肌肉生長抑制素基因的研究進展
        1.2.1 MSTN基因的概述
        1.2.2 MSTN基因的調控及生物學功能
    1.3 友好位點的研究進展
        1.3.1 H2-Tw3位點
        1.3.2 Hprt位點
        1.3.3 Rosa26位點
        1.3.4 Hipp11 (H11)位點
    1.4 超數(shù)排卵的研究
第二章 CRISPR介導的兔體細胞基因敲除研究
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑及主要試劑配制
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要試劑配制
        1.2 主要儀器
        1.3 引物序列及測序
        1.4 試驗方法
            1.4.1 試驗設計方案
            1.4.2 CRISPR/Cas9作用靶點確定及sgRNA的設計與合成
            1.4.3 Cas9表達載體的構建
            1.4.4 兔胚胎成纖維細胞的分離及培養(yǎng)
            1.4.5 CRISPR/Cas9去內(nèi)毒素質粒的提取
            1.4.6 電轉染家兔胚胎成纖維細胞
    2 結果與分析
        2.1 靶位點的確定及sgRNA設計
        2.2 Cas9/gRNA表達載體的構建和鑒定
        2.3 載體構建測序結果
        2.4 EGFP的表達及轉染效率
        2.5 Cas9/gRNA敲除效率
    3 討論
    4 結論
第三章 CRISPR介導GFP在兔體細胞定點整合研究
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 引物序列及測序
        1.4 試驗方法
            1.4.1 試驗設計方案
            1.4.2 序列比對
            1.4.3 sgRNA的設計和制備
            1.4.4 構建CRISPR/Cas9敲除載體
            1.4.5 引物設計
            1.4.6 同源打靶載體的構建
            1.4.7 兔胚胎成纖維細胞的復蘇
            1.4.8 嘌呤霉素篩選兔胚胎成纖維細胞濃度確定
            1.4.9 敲除載體與同源打靶載體共轉染兔胚胎成纖維細胞
            1.4.10 嘌呤霉素篩選細胞
            1.4.11 打靶細胞的檢測
    2 結果與分析
        2.1 豬與小鼠與人的H11位點周圍環(huán)境序列比對結果
        2.2 家兔基因組鑒定小鼠Rosa 26 的同源性
        2.3 CRISPR/Cas9的構建和活性分析
        2.4 同源打靶載體的構建
            2.4.1 pIRES2 -ZsGreen1-Puro載體的構建
            2.4.2 pIRES2 -ZsGreen1-H11- Puro-3’Arm和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26- Puro-3’Arm載體的構建
            2.4.3 終載體pIRES2 -ZsGreen1-H11-Puro和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26-Puro
        2.5 細胞實驗結果
            2.5.1 嘌呤霉素最佳濃度的篩選
            2.5.2 敲除載體與同源打靶載體共轉染兔胚胎成纖維細胞
        2.6 打靶細胞的檢測
    3 討論
    4 結論
第四章 兔胚胎的高效制備
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 試驗動物
            1.1.2 試驗藥品和試驗器械
        1.2 家兔超數(shù)排卵的方法
            1.2.1 PMSG+HCG
            1.2.2 FSH+HCG
            1.2.3 原核期供體兔胚胎的采集
            1.2.4 統(tǒng)計分析
    2 結果
        2.1 不同劑量PMSG的超排效果
        2.2 不同超排處理方法對母兔超排效果的影響
    3 討論
        3.1 不同劑量PMSG的超排效果
        3.2 不同超排方法對母兔超排效果的影響
    4 結論
參考文獻
導師評閱表


【參考文獻】：
期刊論文
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[7]用不同方法對不同年齡的家兔超排效果比較[J]. 胡小九,孫新明,王煒.  動物醫(yī)學進展. 2001(02)
[8]影響兔超數(shù)排卵因素的研究[J]. 廉穎,李勁松,朱子玉,廉莉,吳昱琪.  中國獸醫(yī)科技. 2001(04)
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[10]超數(shù)排卵及其存在的問題[J]. 譚景和,秦■春.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 1987(05)

碩士論文
[1]基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因打靶研究[D]. 劉倩男.河南大學 2015
[2]家兔超數(shù)排卵影響因素的研究[D]. 金虎.延邊大學 2006



本文編號：3706471