利用基因敲除的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物我們可以直接檢測(cè)疾病病理發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,揭示基因、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)與病因癥狀之間的關(guān)系。轉(zhuǎn)基因兔已成為基因功能研究、人類(lèi)疾病模型建立和高價(jià)值藥用蛋白生產(chǎn)的重要工具。小鼠的Rosa26基因座已被廣泛應(yīng)用于外源基因的定點(diǎn)整合。近年來(lái),關(guān)于豬的Rosa26位點(diǎn)也有相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了研究,并成功培育了轉(zhuǎn)基因豬。小鼠的第11號(hào)染色體上存在一個(gè)安全位點(diǎn),在2010年時(shí)該位點(diǎn)被斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)成功分離并鑒定出來(lái),命名為hipp11位點(diǎn),簡(jiǎn)稱(chēng)H11位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于Drg1基因的9號(hào)外顯子和Eif4enif1基因的19號(hào)外顯子之間,大小約5kb。由于位于間隔序列中,因此有很高的安全性,不容易被基因沉默,在多種細(xì)胞中都可以表達(dá)。目的:本研究以家兔為研究對(duì)象,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),目的是改進(jìn)兔遺傳操作體系,建立成熟高效的兔基因敲除平臺(tái),對(duì)基因工程兔的推廣應(yīng)用具有重要意義。為基因功能研究、人類(lèi)疾病動(dòng)物模型和高價(jià)值蛋白乳腺生物反應(yīng)器研制提供新手段、新方法。方法:⑴利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)根據(jù)家兔的MSTN基因構(gòu)建敲除載體,在細(xì)胞水平驗(yàn)證其敲除效率。⑵通過(guò)生物信息學(xué)鑒定家... 

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
主要符號(hào)表
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)
        1.1.1 工程核酸酶精確的編輯基因
        1.1.2 Cas9: RNA介導(dǎo)的基因組編輯
        1.1.3 與其他基因組編輯技術(shù)的比較
        1.1.4 Cas9 系統(tǒng)的局限性
    1.2 肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究進(jìn)展
        1.2.1 MSTN基因的概述
        1.2.2 MSTN基因的調(diào)控及生物學(xué)功能
    1.3 友好位點(diǎn)的研究進(jìn)展
        1.3.1 H2-Tw3位點(diǎn)
        1.3.2 Hprt位點(diǎn)
        1.3.3 Rosa26位點(diǎn)
        1.3.4 Hipp11 (H11)位點(diǎn)
    1.4 超數(shù)排卵的研究
第二章 CRISPR介導(dǎo)的兔體細(xì)胞基因敲除研究
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑及主要試劑配制
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要試劑配制
        1.2 主要儀器
        1.3 引物序列及測(cè)序
        1.4 試驗(yàn)方法
            1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
            1.4.2 CRISPR/Cas9作用靶點(diǎn)確定及sgRNA的設(shè)計(jì)與合成
            1.4.3 Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.4.4 兔胚胎成纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
            1.4.5 CRISPR/Cas9去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
            1.4.6 電轉(zhuǎn)染家兔胚胎成纖維細(xì)胞
    2 結(jié)果與分析
        2.1 靶位點(diǎn)的確定及sgRNA設(shè)計(jì)
        2.2 Cas9/gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
        2.3 載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果
        2.4 EGFP的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率
        2.5 Cas9/gRNA敲除效率
    3 討論
    4 結(jié)論
第三章 CRISPR介導(dǎo)GFP在兔體細(xì)胞定點(diǎn)整合研究
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 引物序列及測(cè)序
        1.4 試驗(yàn)方法
            1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
            1.4.2 序列比對(duì)
            1.4.3 sgRNA的設(shè)計(jì)和制備
            1.4.4 構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體
            1.4.5 引物設(shè)計(jì)
            1.4.6 同源打靶載體的構(gòu)建
            1.4.7 兔胚胎成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇
            1.4.8 嘌呤霉素篩選兔胚胎成纖維細(xì)胞濃度確定
            1.4.9 敲除載體與同源打靶載體共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細(xì)胞
            1.4.10 嘌呤霉素篩選細(xì)胞
            1.4.11 打靶細(xì)胞的檢測(cè)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 豬與小鼠與人的H11位點(diǎn)周?chē)h(huán)境序列比對(duì)結(jié)果
        2.2 家兔基因組鑒定小鼠Rosa 26 的同源性
        2.3 CRISPR/Cas9的構(gòu)建和活性分析
        2.4 同源打靶載體的構(gòu)建
            2.4.1 pIRES2 -ZsGreen1-Puro載體的構(gòu)建
            2.4.2 pIRES2 -ZsGreen1-H11- Puro-3’Arm和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26- Puro-3’Arm載體的構(gòu)建
            2.4.3 終載體pIRES2 -ZsGreen1-H11-Puro和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26-Puro
        2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.5.1 嘌呤霉素最佳濃度的篩選
            2.5.2 敲除載體與同源打靶載體共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細(xì)胞
        2.6 打靶細(xì)胞的檢測(cè)
    3 討論
    4 結(jié)論
第四章 兔胚胎的高效制備
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 試驗(yàn)藥品和試驗(yàn)器械
        1.2 家兔超數(shù)排卵的方法
            1.2.1 PMSG+HCG
            1.2.2 FSH+HCG
            1.2.3 原核期供體兔胚胎的采集
            1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果
        2.1 不同劑量PMSG的超排效果
        2.2 不同超排處理方法對(duì)母兔超排效果的影響
    3 討論
        3.1 不同劑量PMSG的超排效果
        3.2 不同超排方法對(duì)母兔超排效果的影響
    4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
導(dǎo)師評(píng)閱表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]吉富羅非魚(yú)MSTN基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性[J]. 唐永凱,李建林,俞菊華,陳雪峰,李紅霞.  中國(guó)水產(chǎn)科學(xué). 2010(01)
[2]品種及兔齡對(duì)家兔超數(shù)排卵的影響[J]. 唐修君,陳麗,鄒海軍,王杏龍.  甘肅畜牧獸醫(yī). 2007(02)
[3]家兔超數(shù)排卵的研究[J]. 楊小淦,江明生,盧晟盛,朱佳杰,任子利,陸陽(yáng)清,張明,盧克煥.  廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué). 2006(S1)
[4]中國(guó)大白兔的超數(shù)排卵效果比較[J]. 丁志麗,戴榮亮,周俊波,王杏龍.  河南畜牧獸醫(yī). 2005(11)
[5]電穿孔導(dǎo)入綠色熒光蛋白基因于綿羊胎兒成纖維細(xì)胞研究[J]. 王海,陸泉枝,連正興,李寧,吳常信.  中國(guó)畜牧雜志. 2004(02)
[6]兔超數(shù)排卵的比較試驗(yàn)[J]. 劉亞,張運(yùn)海,章美玲,李東偉,趙煥,謝振宣,王希春.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2003(04)
[7]用不同方法對(duì)不同年齡的家兔超排效果比較[J]. 胡小九,孫新明,王煒.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2001(02)
[8]影響兔超數(shù)排卵因素的研究[J]. 廉穎,李勁松,朱子玉,廉莉,吳昱琪.  中國(guó)獸醫(yī)科技. 2001(04)
[9]兩種劑量的PMSG對(duì)兔超數(shù)排卵效果的影響[J]. 王海霞,賀桂馨,李武,張貴學(xué).  黑龍江動(dòng)物繁殖. 1997(03)
[10]超數(shù)排卵及其存在的問(wèn)題[J]. 譚景和,秦■春.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 1987(05)

碩士論文
[1]基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因打靶研究[D]. 劉倩男.河南大學(xué) 2015
[2]家兔超數(shù)排卵影響因素的研究[D]. 金虎.延邊大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3706471