吡啶及其衍生物在自然界中普遍存在,6-羥基煙酸（6HNA）作為吡啶衍生物中重要的化工中間體,化學合成困難,而微生物轉(zhuǎn)化的方法因其溫和、流程簡單和產(chǎn)品純度高等優(yōu)點具有廣闊的應用前景。本研究以尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2為對象,研究了其降解煙酸（NA）的特性、代謝途徑及分子降解機制。通過基因組測序和生物信息比較相結合的方法克隆到一個新的三組分編碼煙酸羥化酶的基因,為綠色轉(zhuǎn)化6HNA的生產(chǎn)提供了理論方法和依據(jù)。研究內(nèi)容主要包括以下三個方面:（1）研究了菌株T2對NA的降解特性,并對其代謝途徑進行了推測。結果顯示:菌株T2對NA的最適降解條件為30℃和pH7.0;當接種量OD600為0.60時,可以在3.5個小時內(nèi)將濃度為300 mg/L的NA完全降解;推測其降解途徑為 NA→6HNA→2,5-DHP→→TCA 循環(huán)。（2）通過對菌株T2進行全基因組測序,獲得了基因組序列的精細圖譜（52個Scaffolds）。菌株T2的基因組大小為3.3 Mb,GC含量為56.9%。生物信息學表明,該菌株基因組編碼3054個開放閱讀框。利用RAST、nr、Swiss-Prot、COG、KE... 

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
符號與縮略語說明
第一章 緒論
    1.1 煙堿類殺蟲劑
        1.1.1 煙堿類殺蟲劑的發(fā)展
        1.1.2 煙堿類殺蟲劑中間體的研究
    1.2 煙酸和6-羥基煙酸的簡介
        1.2.1 煙酸和6-羥基煙酸的基本性質(zhì)
        1.2.2 煙酸和6-羥基煙酸的用途
    1.3 煙酸的微生物降解的研究進展
        1.3.1 降解煙酸的微生物種類
        1.3.2 煙酸的微生物代謝途徑及酶學研究
    1.4 本論文研究目的、意義和主要內(nèi)容
        1.4.1 研究目的和意義
        1.4.2 研究的主要內(nèi)容
第二章 煙酸降解菌的生長及降解特性研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株、試劑及儀器
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 緩沖液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株T2對煙酸降解能力的初步驗證
        2.2.2 菌株T2種子液的制備
        2.2.3 菌株T2的生物量及煙酸殘留量和中間代謝產(chǎn)物的檢測方法
        2.2.4 外界條件對菌株T2降解特性的影響
        2.2.5 菌株T2生長與煙酸降解關系的探究
    2.3 實驗結果與分析
        2.3.1 菌株T2對煙酸的降解能力
        2.3.2 pH值對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.3 溫度對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.4 接種量對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.5 煙酸初始濃度對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.6 菌株T2對煙酸的利用
        2.3.7 菌株T2降解代謝產(chǎn)物的鑒定
    2.4 本章小結
第三章 Pusillimonas sp. T2基因組測序、功能注釋分析及基因比較
    3.1 實驗材料與方法
        3.1.1 菌株,試劑與培養(yǎng)基
        3.1.2 基因組DNA提取
        3.1.3 全基因組序列上機文庫的構建
        3.1.4 生物學信息分析
        3.1.5 煙酸降解關鍵基因的查找和生物信息學分析
    3.2 結果與分析
        3.2.1 菌株T2基因組DNA提取
        3.2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計
        3.2.3 基因組序列的組裝
        3.2.4 預測基因結果
        3.2.5 rRNA/tRNA預測結果
        3.2.6 基因功能注釋結果
        3.2.7 煙酸代謝相關基因分析
    3.3 本章小結
第四章 煙酸降解關鍵基因nahAB_1B_2的克隆與功能鑒定
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株及實驗儀器
        4.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        4.1.3 主要試劑及緩沖液
        4.1.4 引物設計
    4.2 實驗方法
        4.2.1 菌株T2基因組DNA提取
        4.2.2 菌株T2基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測
        4.2.3 質(zhì)粒DNA的小量提取
        4.2.4 Over-lap PCR構建同源重組片段
        4.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        4.2.6 表達載體的構建
    4.3 實驗結果與分析
        4.3.1 菌株T2基因組DNA提取
        4.3.2 nahA、nahAB_1和nahB_2的特異性擴增
        4.3.3 載體pBBR-MCS2酶切
        4.3.4 重組菌株的煙酸降解功能驗證
    4.4 本章小結
第五章 酶學特性研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 菌株、質(zhì)粒及實驗儀器
        5.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        5.1.3 主要試劑及緩沖液
    5.2 實驗方法
        5.2.1 表達菌株的誘導與表達
        5.2.2 蛋白的功能鑒定
    5.3 菌株HZN7-pBBR-nahAB_1B_2粗酶液特性研究
        5.3.1 粗酶液中蛋白含量測定
        5.3.2 NahAB_1B_2的動力學參數(shù)
        5.3.3 金屬離子對酶活力的影響
        5.3.4 O_2消耗檢測
        5.3.5 NahAB_1B_2底物特異性檢測
    5.4 實驗結果與分析
        5.4.1 NahAB_1B_2的活性
        5.4.2 酶含量和酶動力學參數(shù)
        5.4.3 金屬離子對NahAB_1B_2酶活的影響
        5.4.4 NahAB_1B_2催化反應中O_2的來源
        5.4.5 NahAB_1B_2的底物特異性
    5.5 本章小結
第六章 總結與展望
    6.1 研究內(nèi)容及結論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 不足與展望
參考文獻
附錄1: 儀器設備
附錄2: 文中所用培養(yǎng)基及試劑配方
附錄3: 緩沖液
附錄4: 相關DNA序列
作者簡介
    1 作者簡歷
    2 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文
    3 參與的科研項目
學位論文數(shù)據(jù)集


【參考文獻】：
期刊論文
[1]淺析煙堿類殺蟲劑及其市場走勢[J]. 劉智.  農(nóng)藥市場信息. 2017 (22)
[2]吡蟲啉對番茄的逆境屏蔽效應及對溫室白粉虱的防控效果[J]. 劉中良,鄭建利,高俊杰,田昌庚.  北方農(nóng)業(yè)學報. 2017(01)
[3]蛋白質(zhì)含量測定方法的規(guī)范化研究[J]. 邵泓,呂晶,陳鋼.  中國藥品標準. 2011(02)
[4]3種方法測定大鼠肝微粒體蛋白含量的比較[J]. 簡暾昱,徐帆,廖春龍,徐貴麗.  中國藥師. 2011(03)
[5]取代劇毒農(nóng)藥的新一代煙堿類殺蟲劑[J]. 程志明.  上海化工. 2007(09)
[6]睪酮叢毛單胞菌JA1菌株羥基化煙酸產(chǎn)生6-羥基煙酸的發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究[J]. 楊瑤,袁生,戴亦軍.  工業(yè)微生物. 2007(04)
[7]農(nóng)藥對我國農(nóng)產(chǎn)品污染的現(xiàn)狀及控制對策[J]. 張青,周國強.  洛陽大學學報. 2007(02)
[8]煙酸用于一氯均三嗪型活性染料中性浴上染真絲綢的研究[J]. 董瑋,謝維斌,何瑾馨.  紡織科技進展. 2007(01)
[9]新型煙堿類殺蟲劑啶蟲脒研究進展[J]. 周育,庾琴,侯慧鋒,喬雄梧,李順鵬.  植物保護. 2006(03)
[10]煙酸的研究進展[J]. 李艷云,尹振晏,宮彩紅.  北京石油化工學院學報. 2006(01)

博士論文
[1]吡啶衍生物的微生物羥基化及其酶的基因克隆與表達的研究[D]. 楊瑤.南京師范大學 2008

碩士論文
[1]尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2的篩選、鑒定、降解特性及代謝途徑的初步研究[D]. 溫榮提.浙江工業(yè)大學 2015



本文編號：3698915