發(fā)布時間：2022-10-30 12:33

　　CRISPR/Cas9是近年來發(fā)現(xiàn)的新的一種基因編輯技術(shù),CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）,即規(guī)律的、成簇的、間隔短回文重復(fù),它是存在于古細菌和細菌中的多個短重復(fù)序列,為自身提供特異性保護機制,用來抵抗外源DNA的入侵。經(jīng)過探索,這一系統(tǒng)已運用于科學(xué)研究,科研人員只需針對目的基因設(shè)計對應(yīng)的sgRNA,將其連接到對應(yīng)的載體上,轉(zhuǎn)入所要研究的對象中,然后運用PCR和Western Blotting檢測相應(yīng)基因的表達。CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其操作較簡單、編輯效率較高、成本較低、耗時較短而被廣泛運用到生物和醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。本課題主要分為兩個部分。一是基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立MTMR14穩(wěn)定敲減細胞株及后續(xù)表型分析。首先,我們設(shè)計了4對針對人源MTMR14的sgRNA,將其連接到PX458載體上,將其轉(zhuǎn)染到293T細胞中,293T是一種工具細胞,易于轉(zhuǎn)染和操作,然后通過測序和蛋白檢測,我們得到了MTMR14基因敲減的293T細胞系。在成功搭建了CRISPR/Cas9技術(shù)平臺后我們著重... 

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
Part Ⅰ MTMR14穩(wěn)定敲減細胞株的建立及表型分析
    第一章 緒論
        1.1 早期基因編輯技術(shù)
            1.1.1 RNAi技術(shù)
            1.1.2 ZFN技術(shù)
            1.1.3 TALEN技術(shù)
        1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)
            1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)起源
            1.2.2 CRISPR/Cas分類
            1.2.3 CRISPR/Cas9作用機理
            1.2.4 CRISPR/Cas9的應(yīng)用
                1.2.4.1 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域
                1.2.4.2 動物科學(xué)領(lǐng)域
                1.2.4.3 植物科學(xué)領(lǐng)域
                1.2.4.4 微生物學(xué)領(lǐng)域
        1.3 MTMR14研究進展
            1.3.1 概述
            1.3.2 MTMR14的發(fā)現(xiàn)
            1.3.3 MTMR14的基因和蛋白
            1.3.4 MTMR14的生物學(xué)功能
                1.3.4.1 MTMR14與CNM
                1.3.4.2 MTMR14與鈣離子調(diào)節(jié)
                1.3.4.3 MTMR14與自噬
        1.4 本文構(gòu)思
            1.4.1 選題緣由
            1.4.2 研究內(nèi)容
            1.4.3 研究目的及意義
    第二章 實驗材料、儀器和試劑
        2.1 實驗材料
        2.2 實驗儀器和耗材
            2.2.1 實驗儀器
            2.2.2 實驗耗材
        2.3 實驗試劑
        2.4 溶液配制
            2.4.1 構(gòu)載體所需溶液
            2.4.2 細胞培養(yǎng)所需溶液
            2.4.3 WesternBlotting所需溶液
            2.4.4 MTT所需溶液
            2.4.5 流式細胞術(shù)所需溶液
    第三章 實驗方法
        3.1 構(gòu)建基因敲減細胞系
            3.1.1 hMTMR14sgRNA序列的設(shè)計
            3.1.2 PX458-sgRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定
            3.1.3 細胞培養(yǎng)
                3.1.3.1 細胞復(fù)蘇
                3.1.3.2 細胞換液與傳代
                3.1.3.3 細胞凍存
            3.1.4 細胞轉(zhuǎn)染
                3.1.4.1 提質(zhì)粒
                3.1.4.2 Lipo-2000轉(zhuǎn)染
                3.1.4.3 Lipo-3000轉(zhuǎn)染
            3.1.5 流式細胞儀分選
            3.1.6 單細胞培養(yǎng)
            3.1.7 測序鑒定
                3.1.7.1 提取細胞基因組
                3.1.7.2 PCR擴增細胞基因組和測序
            3.1.8 錯配酶酶切鑒定
            3.1.9 Western Blotting檢測MTMR14的表達
                3.1.9.1 細胞總蛋白的提取
                3.1.9.2 Western Blotting
        3.2 MTT檢測細胞生長速率
            3.2.1 細胞計數(shù)
            3.2.2 測定標(biāo)準曲線
            3.2.3 測定細胞生長速率
        3.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期
            3.3.1 細胞收集與固定
            3.3.2 細胞染色及檢測
        3.4 Real-time PCR檢測細胞周期調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平
            3.4.1 總RNA的提取
            3.4.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR
            3.4.3 Real-time PCR
        3.5 統(tǒng)計分析
    第四章 MTMR14基因敲減細胞系的建立
        4.1 構(gòu)建MTMR14基因敲減的293T細胞
            4.1.1 引言
            4.1.2 分析PX458載體序列
            4.1.3 構(gòu)建PX458-sgRNA表達載體
            4.1.4 細胞轉(zhuǎn)染以及流式細胞分選
            4.1.5 PCR和測序分析流式分選細胞基因組序列
            4.1.6 PX458-sgRNA表達載體的靶向敲除效果檢測
        4.2 構(gòu)建基因敲減的A549細胞
            4.2.1 引言
            4.2.2 細胞轉(zhuǎn)染
            4.2.3 分選細胞的基因組測序分析
            4.2.4 PX458-sgRNA表達載體的靶向敲除效果檢測
        4.3 小結(jié)
    第五章 MTMR14基因敲減的A549細胞系表型分析
        5.1 引言
        5.2 實驗結(jié)果與分析
            5.2.1 MTT檢測MTMR14表達的減少對細胞增殖的影響
            5.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期
            5.2.3 Real-timePCR檢測細胞周期調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平
        5.3 小結(jié)
    第六章 討論與展望
Part Ⅱ 基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立RhoA基因敲除小鼠
    第一章 前言
        1.1 CRISPR/Cas9建立基因敲除小鼠概述
        1.2 RhoA概述
        1.3 本文構(gòu)想
    第二章 實驗材料、儀器和試劑
        2.1 實驗材料
        2.2 實驗儀器
        2.3 實驗試劑
    第三章 實驗方法
        3.1 sgRNA和檢測引物的設(shè)計
        3.2 sgRNA體外活性檢測
            3.2.1 PCR擴增反應(yīng)
            3.2.2 檢測和回收PCR產(chǎn)物
            3.2.3 gRNA轉(zhuǎn)錄
            3.2.4 回收和提取gRNA
            3.2.5 用于酶切的dsDNA擴增和切膠回收
            3.2.6 spCas9/gRNA體外酶切反應(yīng)
        3.3 體外轉(zhuǎn)錄sgRNA/Cas9mRNA
        3.4 超排卵與小鼠受精卵的獲取
        3.5 小鼠受精卵顯微注射sgRNA/Cas9mRNA
        3.6 胚胎移植
        3.7 利用PCR和測序?qū)0代小鼠進行基因型鑒定
    第四章 實驗結(jié)果
        4.1 體外sgRNA活性檢測
        4.2 體外轉(zhuǎn)錄sgRNA/Cas9mRNA
        4.3 顯微注射
        4.4 胚胎移植
        4.5 基因型鑒定
        4.6 小結(jié)
    第五章 討論與展望
參考文獻
致謝
附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]應(yīng)用RGS雙熒光替代性報告載體提高CRISPR/Cas9對豬BMP15基因的打靶效率[J]. 王敏,石翾,黃翔,劉小鳳,覃玉鳳,劉小紅,陳瑤生,何祖勇.  遺傳. 2017(01)



本文編號：3698894