洛蒙德鏈霉菌S015（Streptomyces lomondensis S015）能夠生物合成吩嗪類化合物洛蒙真菌素（Lomofungin）。而洛蒙真菌素是一種廣譜抗生素,能夠抗細(xì)菌、真菌及腫瘤,因此在很多領(lǐng)域都有其應(yīng)用價(jià)值。由于S015菌株的洛蒙真菌素產(chǎn)量較低,難以滿足研究和生產(chǎn)的要求,因此本論文從S015菌株出發(fā),通過建立高通量篩選方法,復(fù)合誘變篩選及基因工程改造來構(gòu)建其高產(chǎn)菌株。本論文根據(jù)洛蒙真菌素的2-丁酮溶液在紫外波長375 nm處有一個(gè)特征吸收峰的現(xiàn)象,確定了375 nm是能用來檢測酸性的2-丁酮溶液中的洛蒙真菌素的一個(gè)特征波長。并且驗(yàn)證了溶液中洛蒙真菌素濃度和其A₃₇₅值呈良好的正相關(guān)關(guān)系。所以將洛蒙德鏈霉菌的發(fā)酵液通過2-丁酮萃取等處理后的上層有機(jī)相的A₃₇₅值作為快速判斷其洛蒙真菌素含量的標(biāo)志,同時(shí)結(jié)合利用24孔深孔板培養(yǎng)和酶標(biāo)儀能同時(shí)對(duì)大量樣本進(jìn)行分析檢測的優(yōu)點(diǎn),成功建立了高通量篩選高產(chǎn)洛蒙真菌素菌株的方法。隨后利用該高通量篩選方法,從S015菌株出發(fā),進(jìn)行了6輪ARTP和紫外誘變交替的復(fù)合誘變育種,累計(jì)篩選了4,320株... 

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 傳統(tǒng)誘變育種
        1.1.1 物理誘變
        1.1.2 化學(xué)誘變
        1.1.3 生物誘變
    1.2 新型誘變育種
        1.2.1 ARTP誘變育種
        1.2.2 微波誘變育種
        1.2.3 超高壓誘變育種
        1.2.4 復(fù)合誘變育種
    1.3 高通量篩選方法
    1.4 吩嗪類化合物
    1.5 天然吩嗪類化合物的生物合成
        1.5.1 吩嗪合成前體合成途徑——莽草酸途徑
        1.5.2 吩嗪合成途徑
    1.6 洛蒙德鏈霉菌和洛蒙真菌素
        1.6.1 洛蒙德鏈霉菌
        1.6.2 洛蒙真菌素的合成途徑
    1.7 本研究的目的、內(nèi)容和意義
第二章 高產(chǎn)洛蒙真菌素的洛蒙德鏈霉菌的高通量篩選方法的建立
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 培養(yǎng)基
        2.2.2 菌株及培養(yǎng)條件
        2.2.3 試劑和儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 高通量篩選及驗(yàn)證方法
        2.3.2 洛蒙真菌素產(chǎn)量測定
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 洛蒙真菌素濃度與A375的關(guān)系
        2.4.2 運(yùn)用A375建立高通量篩選方法
        2.4.3 檢驗(yàn)并對(duì)比分析所建立的篩選方法
    2.5 本章小結(jié)
第三章 高產(chǎn)洛蒙真菌素的洛蒙德鏈霉菌的復(fù)合誘變育種
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 培養(yǎng)基
        3.2.2 試劑和儀器
        3.2.3 菌株
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 ARTP誘變及篩選
        3.3.2 紫外誘變及篩選
        3.3.3 洛蒙真菌素產(chǎn)量測定
        3.3.4 菌株干重測定
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 致死率曲線
        3.4.2 ARTP和紫外復(fù)合誘變及高通量篩選
    3.5 菌株穩(wěn)定性檢驗(yàn)
    3.6 菌落形態(tài)對(duì)比
    3.7 細(xì)胞生長對(duì)比
    3.8 本章小結(jié)
第四章 高產(chǎn)洛蒙真菌素的洛蒙德鏈霉菌的基因工程改造
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        4.2.2 試劑和儀器
        4.2.3 菌株、質(zhì)粒和引物
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 質(zhì)粒提取
        4.3.2 基因組提取
        4.3.3 PCR擴(kuò)增、驗(yàn)證目的片段
        4.3.4 DNA片段回收
        4.3.5 雙酶切DNA片段與載體、連接
        4.3.6 菌株的保存
        4.3.7 ET12567 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.3.8 基因缺失菌株構(gòu)建
        4.3.9 基因過表達(dá)菌株構(gòu)建
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 高產(chǎn)菌株M6中trpE1、trpE2 基因的敲除
        4.4.2 trpE1、trpE2 基因的敲除對(duì)M6 菌株洛蒙真菌素產(chǎn)量的影響
        4.4.3 過表達(dá)全局調(diào)控基因afsR對(duì) M6 菌株洛蒙真菌素產(chǎn)量的影響
        4.4.4 cutR和 cutS基因的敲除
        4.4.5 cutR和 cutS雙組分調(diào)控系統(tǒng)對(duì)M6 菌株洛蒙真菌素產(chǎn)量的影響
        4.4.6 分支酸合成途徑中aroA、aroB、aroC和 aroK基因的過表達(dá)
        4.4.7 過表達(dá)aroA、aroB、aroC和 aroK基因?qū)6 菌株洛蒙真菌素的影響
        4.4.8 組合過表達(dá)aroB1、aroB2、aroK1和aroK2 基因?qū)6 菌株產(chǎn)量的影響
        4.4.9 培養(yǎng)基優(yōu)化對(duì)M6ΔtrpE1ΔtrpE2::afsR菌株洛蒙真菌素產(chǎn)量的影響
        4.4.10 培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化
    4.5 本章小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄1 本研究中所用試劑
附錄2 本研究中所用儀器
附錄3 本研究中相關(guān)基因序列
    1 )洛蒙德鏈霉菌S015的trpE1 基因(1251 bp):
    2 )洛蒙德鏈霉菌S015的trpE2 基因(1482 bp):
    3 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroA1 基因(816 bp):
    4 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroA2 基因(1317 bp):
    5 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroB1 基因(1080 bp):
    6 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroB2 基因(1020 bp):
    7 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroC1 基因(1134 bp):
    8 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroC2 基因(1185 bp):
    9 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroK1 基因(603 bp):
    10 )洛蒙德鏈霉菌S015的aroK2 基因(477 bp):
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]洛蒙德鏈霉菌S015中吩嗪類代謝產(chǎn)物的鑒定及高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建[D]. 張茁.上海交通大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3695830