我國貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的同時(shí),出現(xiàn)了一系列病原體入侵引起的健康問題,嚴(yán)重制約著海洋生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展。挖掘貝類響應(yīng)病原菌脅迫的關(guān)鍵因子,可為貝類的免疫防御機(jī)制研究提供可靠的數(shù)據(jù)支撐,同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖過程中的疾病控制和健康管理具有十分重要的理論意義。本論文在菲律賓蛤仔中克隆出兩種免疫相關(guān)分子——C型凝集素（VpClec-1、VpClec-2）,對(duì)其序列進(jìn)行分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）,對(duì)兩種C型凝集素在菲律賓蛤仔中的組織分布特性進(jìn)行研究;構(gòu)建相應(yīng)的重組蛋白,并對(duì)其免疫活性進(jìn)行具體探究,得到研究結(jié)果如下:（1）基因序列分析結(jié)果顯示,菲律賓蛤仔VpClec-1基因cDNA序列的全長為588 bp,開放閱讀框（ORF）為489 bp,編碼162個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為pI=4.26,蛋白預(yù)測分子量為15.98 kDa;VpClec-2基因cDNA序列的全長為688 bp,ORF為555 bp,編碼184個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為p I=8.40,蛋白預(yù)測分子量為18.74 kDa。對(duì)VpClec-1和VpClec-2基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析、多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)兩種基因均與C型凝集素序列和... 

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 無脊椎動(dòng)物的固有免疫
    1.2 凝集素研究進(jìn)展
        1.2.1 凝集素簡介
        1.2.2 動(dòng)物凝集素的分類
            1.2.2.1 C型凝集素
            1.2.2.2 S型凝集素(半乳糖凝集素)
            1.2.2.3 Pentraxins
            1.2.2.4 P型凝集素
            1.2.2.5 L型凝集素
    1.3 弧菌對(duì)海水養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害
    1.4 本研究目的和意義
    1.5 本研究技術(shù)路線圖
第2章 菲律賓蛤仔VpClec-1和VpClec-2 基因克隆和序列分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用主要引物信息
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菲律賓蛤仔組織樣品的處理
        2.2.2 菲律賓蛤仔總RNA的提取
        2.2.3 菲律賓蛤仔總cDNA的合成
        2.2.4 基因VpCle-1和VpClec-2的RACE技術(shù)擴(kuò)增
        2.2.5 基因VpCle-1和VpClec-2 的生物信息學(xué)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 基因VpCle-1和VpClec-2的c DNA全長及序列特征
        2.3.2 基因VpCle-1和VpClec-2 的多序列比對(duì)特征
        2.3.3 基因VpCle-1和VpClec-2 的系統(tǒng)進(jìn)化特征
    2.4 實(shí)驗(yàn)討論
第3章 菲律賓蛤仔VpClec-1和VpClec-2 基因表達(dá)規(guī)律
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)所用主要引物信息
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 菲律賓蛤仔組織樣品的處理
        3.2.2 菲律賓蛤仔總RNA的提取
        3.2.3 菲律賓蛤仔總cDNA的合成
        3.2.4 基因VpCle-1和VpClec-2的RACE技術(shù)擴(kuò)增
        3.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測基因VpCle-1和VpClec-2 的表達(dá)規(guī)律
        3.2.6 數(shù)據(jù)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 基因VpClec-1和VpClec-2 在菲律賓蛤仔不同組織中的表達(dá)規(guī)律
        3.3.2 基因VpClec-1和VpClec-2 在微生物刺激后的表達(dá)規(guī)律
    3.4 實(shí)驗(yàn)討論
第4章 菲律賓蛤仔VpClec-1和VpClec-2 免疫活性分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)引物
        4.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑配方
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 菲律賓蛤仔組織樣品處理
        4.2.2 菲律賓蛤仔總RNA提取
        4.2.3 菲律賓蛤仔總cDNA合成
        4.2.4 菲律賓蛤仔RACE技術(shù)擴(kuò)增
        4.2.5 目的片段的獲取
        4.2.6 構(gòu)建原核表達(dá)載體
        4.2.7 質(zhì)粒提取
        4.2.8 重組蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的轉(zhuǎn)化
        4.2.9 重組蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的轉(zhuǎn)表達(dá)與檢測
        4.2.10 重組蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的純化
        4.2.11 重組蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的復(fù)性與濃度測定
        4.2.12 抗VpClec-1和VpClec-2 的多克隆抗體制備
        4.2.13 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-Blot)
        4.2.14 rVpClec-1和rVpClec-2的PAMPs結(jié)合活性分析
        4.2.15 rVpClec-1和rVpClec-2 的凝菌活性分析
        4.2.16 rVpClec-1和rVpClec-2 的抑菌活性分析
        4.2.17 rVpClec-1和rVpClec-2 的吞噬活性分析
        4.2.18 rVpClec-1和rVpClec-2 的趨化活性分析
        4.2.19 數(shù)據(jù)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 VpClec-1和VpClec-2 重組蛋白的獲得和多抗制備
        4.3.2 抗VpClec-1和VpClec-2的PAMPs結(jié)合、凝菌和抑菌活性
        4.3.3 rVpClec-1和rVpClec-2 的吞噬和趨化活性
    4.4 實(shí)驗(yàn)討論
第5章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
作者簡歷



本文編號(hào)：3686321