ω-黑麥堿是造成小麥1B/1R易位系加工品質(zhì)差的一個(gè)重要因素,為探索解決這一問(wèn)題,構(gòu)建了ω-黑麥堿基因沉默表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥品種金禾9123,獲得3個(gè)T₀代轉(zhuǎn)基因植株,再經(jīng)連續(xù)的擴(kuò)繁和PCR檢測(cè),獲得純合轉(zhuǎn)基因T₄代株系。酸性PAGE檢測(cè)結(jié)果表明,這些純合轉(zhuǎn)基因株系中ω-黑麥堿的總表達(dá)量平均下降53%。這些ω-黑麥堿基因沉默的轉(zhuǎn)基因株系的面筋指數(shù)、沉降值和穩(wěn)定時(shí)間均顯著提高,而其農(nóng)藝性狀,如株高、穗粒數(shù)、千粒重和小區(qū)產(chǎn)量,均沒(méi)有受到不良影響,說(shuō)明沉默ω-黑麥堿基因可以在不影響產(chǎn)量的前提下提高小麥1B/1R易位系的加工品質(zhì)。 

【文章來(lái)源】：作物學(xué)報(bào). 2016,42(05)北大核心CSCD

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黑麥堿沉默表達(dá)載體pCAMBIA0390-Sec結(jié)構(gòu)示意圖

后稱(chēng)取小區(qū)產(chǎn)量和千粒重,委托河北省農(nóng)作物品種品質(zhì)檢測(cè)中心測(cè)定蛋白質(zhì)含量、吸水率、濕面筋含量、面筋指數(shù)、Zeleny沉降值和穩(wěn)定時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果選用DPSv3.01軟件統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的獲得通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,得到金禾9123的10個(gè)T0代抗性再生植株,其中3株為目的基因PCR陽(yáng)性(圖2)。用100mgL–1Basta溶液涂葉處理表明,PCR陽(yáng)性植株葉片涂抹部位顏色沒(méi)有變化,而其他7株葉片涂抹部位變黃,從而排除了農(nóng)桿菌污染導(dǎo)致PCR假陽(yáng)性的可能性,說(shuō)明目的基因已整合到3個(gè)小麥植株的基因組中。圖2T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)Fig.2ElectrophoregramofPCRproductsfromT0putativetransgenicwheatplantsM:DL2000;–:未轉(zhuǎn)化受體品種(陰性對(duì)照);+:陽(yáng)性質(zhì)粒;1~10:T0代轉(zhuǎn)基因植株。M:DL2000;–:non-transgenicrecipient(negativecontrol);+:positivecontrol;1–10:T0putativetransgenicwheatplants.2.2純合轉(zhuǎn)基因株系的獲得與ω-黑麥堿基因的表達(dá)T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)連續(xù)自交和PCR檢測(cè),從T2代分離群體中獲得純合轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的擴(kuò)繁和PCR檢測(cè),轉(zhuǎn)基因性狀能夠穩(wěn)定遺傳,最終得到3個(gè)T4代純合轉(zhuǎn)基因株系(K1-5、K1-15和K1-16),并且收獲了足夠種子用于小區(qū)產(chǎn)量比較試驗(yàn)。酸性PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,在4個(gè)ω-黑麥堿條帶中,除表達(dá)量最弱的條帶2變化不明顯外,轉(zhuǎn)基因株系的其他3個(gè)黑麥堿條帶的表達(dá)量均顯著降低(圖3),轉(zhuǎn)基因株系ω-黑麥堿基因的總表達(dá)量為受體品種ω-黑麥堿基因總表達(dá)量的47.5%(表1)。其他非黑麥堿條帶沒(méi)有出現(xiàn)一致變?nèi)醯那闆r,說(shuō)明黑麥堿基因沉默具有較高的特異性。

heattransgeniclinesandthenon-transgenicrecipientω黑麥堿條帶ω-secalinband受體對(duì)照Recipientcontrol(%)轉(zhuǎn)基因株系Transgeniclines(%)轉(zhuǎn)基因株系/受體對(duì)照比值Transgeniclines/recipientcontrolratio143.224.6*0.56924.84.80.995336.415.4**0.424415.62.7**0.170合計(jì)Total100.047.5*和**分別表示轉(zhuǎn)基因株系與受體對(duì)照之間在P<0.05和P<0.01水平差異顯著。*and**indicatesignificantdifferencebetweenthetransgeniclineandtherecipientcontrolatP<0.05andP<0.01,respectively.圖3轉(zhuǎn)基因小麥種子中ω黑麥堿的酸性PAGE檢測(cè)Fig.3DetectionofωsecalinintransgenicwheatseedsbyacidPAGECK:受體對(duì)照;A~C:3個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系;1~4:4條ω-黑麥堿條帶。CK:negativecontrol;A–C:threepuretransgeniclines;1–4:fourω-secalinbands.為了解ω-黑麥堿基因表達(dá)沉默對(duì)麥谷蛋白基因表達(dá)的影響,對(duì)3個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系及其對(duì)照進(jìn)行了高低分子量麥谷蛋白的電泳檢測(cè),結(jié)果轉(zhuǎn)基因株系麥谷蛋白各條帶的表達(dá)量與對(duì)照相比沒(méi)有明顯變化(圖4),說(shuō)明ω-黑麥堿基因沉默沒(méi)有影響麥谷蛋白基因的表達(dá)。圖4轉(zhuǎn)基因小麥種子中麥谷蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4DetectionofgluteninsubunitsintransgenicwheatseedsbySDS-PAGECK:受體對(duì)照;1~3:3個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系。CK:negativecontrol;1–3:threehomozygoustransgeniclines.2.3轉(zhuǎn)基因小麥的加工品質(zhì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的籽粒蛋白質(zhì)含量、吸水率和濕面筋含量與受體對(duì)照沒(méi)有顯著差異,但面筋指數(shù)明顯提高,其中2個(gè)株系與對(duì)照達(dá)到顯著差異,沉降值和穩(wěn)定時(shí)間也比對(duì)照顯著提高(表2),說(shuō)明ω-黑麥堿基因的沉默顯著提高了金禾9123的加工品質(zhì)。2.4轉(zhuǎn)基因小麥的農(nóng)藝表現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的株高、?

【參考文獻(xiàn)】：
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