轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制藥已經(jīng)走向產(chǎn)業(yè)化,在國(guó)外,部分醫(yī)用蛋白已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。由于哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞對(duì)重組蛋白的加工、修飾作用,該方法生產(chǎn)的藥用蛋白生物活性高。血栓性疾病嚴(yán)重威脅到了人類的生命健康,其具有很高的發(fā)病率、死亡率。溶栓藥是目前臨床上治療血栓疾病比較常用的方法。重組人組織纖溶酶原激活劑（rhPA）是第三代溶栓藥物,有很好的溶栓效果,但均為原核表達(dá)產(chǎn)品,并且無(wú)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了新穎rhPA乳腺特異性表達(dá)載體,用于制備雙位點(diǎn)整合或單位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因兔。獲得的乳腺特異性rhPA表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化和動(dòng)物試驗(yàn)表明已經(jīng)獲得了乳腺特異性高表達(dá)轉(zhuǎn)基因兔和具有高效溶栓活性的rhPA,為創(chuàng)制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效新穎溶血栓生物藥奠定了基礎(chǔ)。構(gòu)建載體的基本元件為實(shí)驗(yàn)室保存的PCL-25/LTF-Neo和自行設(shè)計(jì)的rhPA基因片段。PCL-25/LTF-Neo通過(guò)Nhe Ⅰ酶切,切膠回收獲得Neor基因片段,PCL-25/rhPA質(zhì)粒用Nhe Ⅰ酶切膠回收獲得線性化的片段。將線性化的PCL-25/rhPA片段和Neor基因片段用T4 DNA連接酶連接,獲得PCL-25/rhPA-Neo質(zhì)粒。將其... 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文名稱及縮寫詞
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 溶栓藥物的發(fā)展
    2. 乳腺生物反應(yīng)器概述
        2.1 腺生物反應(yīng)器原理
        2.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制藥的優(yōu)點(diǎn)
        2.3 利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組t-PA的研究進(jìn)展
        2.4 家兔作為乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)
        2.5 顯微注射法制備乳腺生物反應(yīng)器
    3. 人組織纖溶酶原激活劑概述
        3.1 人組織纖溶酶原激活劑的發(fā)展歷史
        3.2 人組織纖溶酶原激活劑基因序列分析
        3.3 人組織纖溶酶原激活劑機(jī)構(gòu)與功能分析
        3.4 人組織纖溶酶原激活劑變構(gòu)體
    4. 多基因表達(dá)研究
        4.1 轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)機(jī)制的概述
        4.2 外源基因的表達(dá)水平與整合位點(diǎn)的位置效應(yīng)
        4.3 多基因共表達(dá)的方式
        4.4 單基因載體多重轉(zhuǎn)化
    5. 血栓動(dòng)物模型制備的方法
        5.1 物理?yè)p傷法
        5.2 化學(xué)損傷法
第二章 乳腺特異性表達(dá)rhPA基因載體的構(gòu)建
    1. 材料
        1.1 菌種及質(zhì)粒
        1.2 主要儀器和設(shè)備
        1.3 分子生物學(xué)試劑
        1.4 主要試劑的配制
    2. 方法
        2.1 大量提取PCL25/LTF-Neo質(zhì)粒以及PCL25/rhPA質(zhì)粒
        2.2 從PCL25/LTF-Neo質(zhì)粒中獲取Neo~r基因和PCL25+rhPA質(zhì)粒的線性化
        2.3 Neo~r基因片段插入PCL25/rhPA載體
        2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及重組質(zhì)粒PCL-25/rhPA-Neo的酶切鑒定
        2.5 顯微注射片段PCL-25/rhPA-Neo的回收
    3. 結(jié)果
第三章 多位點(diǎn)整合轉(zhuǎn)rhPA基因兔的制備及其整合表達(dá)檢測(cè)
    1. 材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 主要器材
        1.4 主要藥品與試劑
        1.5 主要試劑的配制
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 用FSH/hCH對(duì)供體母兔進(jìn)行超數(shù)排卵
        2.2 用hCG對(duì)供受體母兔進(jìn)行同期發(fā)情處理
        2.3 超數(shù)排卵的供體母兔與轉(zhuǎn)PCL25/tPA公兔配種
        2.4 手術(shù)法收集供體母兔受精卵
        2.5 原核期兔受精卵顯微注射PCL-25/rhPA-Neo基因片段
        2.6 原核期兔受精卵顯微注射PCL-25/rhPA-Neo基因片段后移植受體母兔
        2.7 受體母兔術(shù)后護(hù)理以及分娩
        2.8 轉(zhuǎn)基PLC-25/rhPA-Neo基因兔的整合檢測(cè)
        2.9 轉(zhuǎn)基因兔的配種及表達(dá)檢測(cè)
    3. 結(jié)果
        3.1 轉(zhuǎn)rhPA基因兔基因組PCR整合檢測(cè)
        3.2 轉(zhuǎn)rhPA基因兔兔奶ELISA檢測(cè)
        3.3 轉(zhuǎn)rhPA基因兔兔奶FAPA檢測(cè)結(jié)果
第四章 小鼠血栓模型的建立及其體內(nèi)溶栓試驗(yàn)
    1. 材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 主要試劑
        1.3 儀器和材料
    2. 方法
        2.1 rhPA的純化及其去除內(nèi)毒素
        2.2 角叉菜膠制備小鼠尾部血栓模型
        2.3 重組產(chǎn)物rhPA治療小鼠尾血栓試驗(yàn)
    3. 結(jié)果
        3.1 不同濃度角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾血栓形成結(jié)果
        3.2 不同濃度純化產(chǎn)物rhPA溶解小鼠尾部血栓試驗(yàn)結(jié)果
討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]蚓激酶表達(dá)產(chǎn)物活性在動(dòng)物體內(nèi)的檢測(cè)[D]. 卜秀娟.吉林大學(xué) 2007
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碩士論文
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本文編號(hào)：3610649