發(fā)布時(shí)間：2022-01-24 02:03

　　肌醇半乳糖苷合成酶基因在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究將大豆Gm GolS基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體p RI101上并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法將Gm GolS轉(zhuǎn)化煙草。經(jīng)卡那霉素抗性篩選及PCR檢測(cè)共獲得3株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株。實(shí)時(shí)熒光量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示OE1株系中Gm GolS基因的表達(dá)量最高。 

【文章來(lái)源】：齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,36(06)

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【部分圖文】：

GmGolS轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNAPCR檢測(cè)1-DL2000分子量標(biāo)記物；2-野生型煙草；3-pRI101-GmGolS重組質(zhì)粒；OE1-OE3：轉(zhuǎn)基因煙草

·24·齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）2020年2.3GmGolS轉(zhuǎn)基因煙草鑒基因組DNAPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，共獲得3株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株（圖3），分別命名為OE1，OE2，OE3。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中GmGolS基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，野生型煙草（WT）中基本檢測(cè)不到GmGolS基因的表達(dá)，OE1中GmGolS基因的表達(dá)量最高，可以選擇OE1進(jìn)行后續(xù)基因功能鑒。3討論GolS作為RFOs生物合成起始的關(guān)鍵酶，能夠催化UDP-半乳糖和肌醇反應(yīng)生成肌醇半乳糖苷，再以此為供體，在棉籽糖合成酶和水蘇糖合成酶的作用下將蔗糖合成棉籽糖和水蘇糖等寡糖[6]。這些可溶性糖不僅可以作為細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可以作為植物適應(yīng)環(huán)境的信號(hào)物質(zhì)[7]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅能夠縮短育種周期，還能使植株優(yōu)良性狀得以保存并穩(wěn)遺傳。因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用將為農(nóng)作物改良提供重要的理論參考和研究基矗煙草作為一種模式植物，經(jīng)常用來(lái)轉(zhuǎn)化目的基因并進(jìn)行基因的功能鑒。前人也有將GolS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行抗性鑒的報(bào)道。例如，在煙草中超表達(dá)牛耳草BhGolS1基因可使轉(zhuǎn)基因植株耐旱能力顯著提高[8]；將苜蓿MfGolS1基因在煙草中超表達(dá)后轉(zhuǎn)基因煙草的抗冷、抗旱和抗鹽性均提高[9]。本研究將大豆GmGolS基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，成功獲得超表達(dá)GmGolS的轉(zhuǎn)基因煙草株系。以往有研究報(bào)道，一些基因在植物體內(nèi)超表達(dá)后會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株的正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重的甚至?xí)䦟?dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的死亡[10-11]。但在本實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)GmGolS轉(zhuǎn)基因煙草株系均沒(méi)有表現(xiàn)出異常生長(zhǎng)現(xiàn)象，可以用來(lái)進(jìn)行后續(xù)的基因功能鑒。由于根癌農(nóng)桿菌T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的，且拷貝數(shù)目可能存在不同，這也是造成3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中GmGolS基因表達(dá)量不同的主

煙草中GmGolS基因的相對(duì)表達(dá)量。2結(jié)果與分析2.1GmGolS植物表達(dá)載體構(gòu)建利用引物兩端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將GmGolS基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101上。如圖1所示，重組質(zhì)粒雙酶切后有目的基因條帶，證明目的基因已經(jīng)整合進(jìn)植物表達(dá)載體中；農(nóng)桿菌菌液PCR擴(kuò)增獲得單一的目的基因條帶，表明已獲含有GmGolS基因的轉(zhuǎn)基因工程菌。2.2GmGolS轉(zhuǎn)基因煙草篩選通過(guò)卡那霉素篩選農(nóng)桿菌侵染后的煙草愈傷組織（圖2A），待抗性芽長(zhǎng)至1cm時(shí)（圖2B）將其移入生根培養(yǎng)基中（圖2C），生根后再移入土中正常生長(zhǎng)。圖2GmGolS轉(zhuǎn)基因煙草的篩選圖1植物表達(dá)載體pRI101-GmGolS構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1-DL2000分子量標(biāo)記物；2-pRI101-GmGolS質(zhì)粒雙酶切；3-農(nóng)桿菌菌液PCR


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