IAA2是擬南芥Aux/IAA生長素響應(yīng)基因大家族中的一員,這類基因在植物生長發(fā)育中起著非常重要的作用,但是目前該基因的失去功能型突變體還沒有報道,阻礙了對其功能和作用機制的深入研究。小立碗蘚由于配子體占主導(dǎo)地位,容易培養(yǎng),容易發(fā)生同源重組,是一種新型的模式植物。擬南芥的LrgB基因與光呼吸和細胞死亡調(diào)控有關(guān),小立碗蘚中有兩個LrgB同源基因,分別為PpLrgB1和PpLrgB2,但是具體功能還不清楚。CRISPR （clustered regulatory interspersed short palindromic repeat- associated endonuclease）是細菌和古菌抵抗外源病毒或質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。Ⅱ型CRISPR/Cas已被改造成一種高效的基因組定點編輯技術(shù)。與鋅指核酸酶（ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)器核酸酶（TALEN）相比,CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、突變率高、費用節(jié)省等優(yōu)點,在各種模式生物和農(nóng)作物中廣泛使用。在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)中,一個gRNA只能靶向基因的一個位點,有時基因敲除的效率并不高。本文中,為了提高敲除效... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
        1.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和類型
        1.1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機制
        1.1.4 作為基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)與ZFN,TELEN的比較
        1.1.5 CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用與發(fā)展
    1.2 IAA2研究背景
    1.3 小立碗蘚的研究進展
第二章 材料和方法
    2.1 實驗材料
    2.2 原始載體
    2.3 入門載體的構(gòu)建
        2.3.1 gRNA靶位點的選擇
        2.3.2 單個gRNA表達框的擴增
        2.3.3 三個gRNA表達框的擴增和串聯(lián)
        2.3.4 轉(zhuǎn)化及陽性克隆鑒定
    2.4 目的載體的構(gòu)建
    2.5 表達載體的構(gòu)建
    2.6 轉(zhuǎn)基因、篩選及種子萌發(fā)
        2.6.1 擬南芥的培養(yǎng)
        2.6.2 電轉(zhuǎn)化
        2.6.3 轉(zhuǎn)基因
        2.6.4 篩選
        2.6.5 種子萌發(fā)
    2.7 數(shù)據(jù)收集
        2.7.1 DNA水平的數(shù)據(jù)收集
        2.7.2 目的基因的擴增
        2.7.3 突變體的檢測
    2.8 小立碗蘚原絲體的培養(yǎng)
    2.9 小立碗蘚原生質(zhì)體的制備
    2.10 PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 序列查找與靶位點設(shè)計
    3.2 兩輪PCR法串聯(lián)多個gRNA表達框的優(yōu)點
    3.3 擬南芥IAA2 T_0代突變的鑒定
    3.4 擬南芥IAA2 T_1代突變的鑒定
    3.5 IAA2突變體測序結(jié)果及突變形式
    3.6 表型觀察與分析
    3.7 PEG介導(dǎo)的小立碗蘚原生質(zhì)體轉(zhuǎn)基因
第四章 討論
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3599132