為研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在雜交水稻恢復(fù)系中的功能,我們利用CRISPR/Cas9定點基因編輯方法,設(shè)計2個敲除靶標(biāo)位點,構(gòu)建了Bsr-d1基因編輯載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系品種‘GH998’,成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并在T1代篩選到4個無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株系。純合突變株系有4種突變類型,包括第199號堿基處缺失17個堿基、第212號堿基處缺失4個堿基、第216號堿基處插入1個堿基、第216號堿基處插入2個堿基突變類型。通過蛋白序列分析,發(fā)現(xiàn)純合突變株系都存在移碼現(xiàn)象導(dǎo)致氨基酸變化并提前終止翻譯。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因編輯方法敲除水稻恢復(fù)系‘GH998’中Bsr-d1基因,獲得無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株系,為進(jìn)一步研究Bsr-d1基因在雜交水稻上的功能提供了理論依據(jù)和品種資源。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(16)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

Bsr-d1基因結(jié)構(gòu)及g RNA靶點位置

將攜帶Bsr-d1基因2個靶標(biāo)的表達(dá)載體CRIS-PR-Cas9-BSRD1通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化恢復(fù)系秈稻‘GH9-98’后，共獲得22株T0代轉(zhuǎn)基因株系。用抗潮霉素基因引物Hyg-F/Hyg-R檢測以篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)22株T0代轉(zhuǎn)基因植株都帶有抗性基因，陽性率為100%。為了分析‘GH998’中Bsr-d1基因的突變情況，用引物BSRD1-F/BSRD1-R擴增基因，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果表明，有13株陽性轉(zhuǎn)基因苗在靶標(biāo)2處發(fā)生了突變，突變率為59.1%，其中有4株為純合突變，占30.8%,9株為雜合突變，占69.2%；而在靶標(biāo)1處沒有檢測到有突變的植株。靶標(biāo)2處的突變基因型包括純合突變和雜合突變，突變類型包括堿基插入和缺失，以堿基缺失為主，占61.5%(表2)。

為了分析‘GH998’中Bsr-d1基因的突變情況，用引物BSRD1-F/BSRD1-R擴增基因，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果表明，有13株陽性轉(zhuǎn)基因苗在靶標(biāo)2處發(fā)生了突變，突變率為59.1%，其中有4株為純合突變，占30.8%,9株為雜合突變，占69.2%；而在靶標(biāo)1處沒有檢測到有突變的植株。靶標(biāo)2處的突變基因型包括純合突變和雜合突變，突變類型包括堿基插入和缺失，以堿基缺失為主，占61.5%(表2)。圖4 重組質(zhì)粒CRISPR-Cas9-BSRD1的PCR驗證

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3591483