利用CRISPR-Cas9技術定點突變鏈霉菌rpsL基因
發(fā)布時間：2022-01-12 22:52
鏈霉菌（Streptomyces）是活性產物的重要來源,其次級代謝產物應用廣泛,可作為抗真菌藥物、抗病毒藥物、抗腫瘤藥物、抗高血壓藥、免疫抑制劑以及抗生素等。近年來從鏈霉菌發(fā)現(xiàn)新化合物的幾率不斷下降。但是基因組學研究結果顯示鏈霉菌含有編碼20個或更多潛在次級代謝物的基因,其中僅一部分在發(fā)酵過程中表達,說明鏈霉菌含有大量沉默基因,在新化合物發(fā)掘和新藥研發(fā)方面仍有巨大潛力。本文期望通過CRISPR-Cas9技術靶向鏈霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突變,改變核糖體穩(wěn)定性,激發(fā)鏈霉菌自身次級代謝物合成潛能,即通過核糖體工程打開鏈霉菌次級代謝產物的合成途徑。在模式菌株天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S突變是激活效果較為明顯的兩種突變。CRISPR-Cas9技術在鏈霉菌中的應用是相對新穎的課題,最早的見刊文獻在2014年年末。建立高效、普遍適用的基因組編輯系統(tǒng)對于后續(xù)喚醒沉默基因及優(yōu)化菌株都具有極其重要的意義。本文首先針對鏈霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系統(tǒng),人工合成了 pCas9-1質粒,對11株海綿共附生鏈霉菌進行遺傳操作。測...
【文章來源】：廈門大學福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：101 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖１．１?１９４０Ｓ至１９９０Ｓ每年從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)抗菌成分趨勢圖［９］??
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【參考文獻】：
期刊論文
[1]鏈霉菌次級代謝物及其應用研究進展[J]. 代芳平,李師翁. 生物技術通報. 2014(03)
[2]鏈霉菌無痕敲除方法研究進展[J]. 谷燕燕,耿偉濤,宋存江. 生物工程學報. 2013(08)
[3]放線菌野生株代謝功能的核糖體工程改造與新產抗腫瘤活性產物研究[J]. 韓曉,崔承彬,韓小賢,李長偉,楊明. 國際藥學研究雜志. 2009(06)
[4]微生物核糖體工程研究進展[J]. 謝庶潔,肖靜,徐俊. 微生物學報. 2009(08)
[5]鏈霉菌次級代謝研究進展[J]. 李歐,繆克排. 中國抗生素雜志. 2005(11)
[6]鏈霉菌次級代謝調控機制進展[J]. 張艷娟,洪斌. 中國生物工程雜志. 2004(12)
博士論文
[1]十一烷基靈菌紅素（metacycloprodigiosin）的提取分離及抗腫瘤活性研究[D]. 李雪萍.中國海洋大學 2009
碩士論文
[1]兩株鏈霉菌次級代謝產物研究[D]. 賴珍珠.廣州醫(yī)科大學 2017
[2]鏈霉菌抗生素生物合成基因簇中調控基因作用機制的初步研究[D]. 黃璐瑤.華中師范大學 2014
[3]海洋來源產木聚糖酶的鏈霉菌菌種篩選與代謝工程改造[D]. 劉卓.大連理工大學 2013
本文編號：3585597
【文章來源】：廈門大學福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：101 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖１．１?１９４０Ｓ至１９９０Ｓ每年從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)抗菌成分趨勢圖［９］??
??防止攻擊自身基因組［４５，５８］。Ｃａｓ９蛋白（如圖１．２藍色）行使剪切ＤＮＡ的功能，??使ＤＮＡ產生雙鏈斷裂（ＤＳＢ）?［３３］。此時，細胞會進行基因修復，如系統(tǒng)中沒有??供體ＤＮＡ分子（ＨＲ模板）存在，會通過ＮＥＨＪ途徑修復，在基因組測序中表??現(xiàn)為基因組片段的缺失。如系統(tǒng)中存在供體ＤＮＡ分子，便可進行同源重組修復??（ＨＲ）。利用該途徑，在修復過程中便可借助供體ＤＮＡ分子實現(xiàn)基因的插入或??突變＠５９］。如果在同一系統(tǒng)中設計兩個ｓｐａｃｅｒ就可特異刪除某一片段，刪除片??段的長度范圍可在２０?ｂｐ至８２．８?ｋｂ［６Ｇ，６Ｉ］。??ｓｇＲＮＡ??＿?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｔｏ??＾％／ａｓ９??Ｍａｔｃｈｉｎｇ?ＤＮＡ?邏?ＰＡＭ??ｔａｒｇｅｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?．?ｓｅｑｕｅｎｃｅ??圖１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９示意圖丨３３】??Ｆｉｇ．１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??１．３．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術在鏈霉菌基因組編輯中的應用??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術在鏈霉菌中的應用相關文獻主要集中在近３年，研宄對象??包括研宄背景較為清楚的模式菌株
??防止攻擊自身基因組［４５，５８］。Ｃａｓ９蛋白（如圖１．２藍色）行使剪切ＤＮＡ的功能，??使ＤＮＡ產生雙鏈斷裂（ＤＳＢ）?［３３］。此時，細胞會進行基因修復，如系統(tǒng)中沒有??供體ＤＮＡ分子（ＨＲ模板）存在，會通過ＮＥＨＪ途徑修復，在基因組測序中表??現(xiàn)為基因組片段的缺失。如系統(tǒng)中存在供體ＤＮＡ分子，便可進行同源重組修復??（ＨＲ）。利用該途徑，在修復過程中便可借助供體ＤＮＡ分子實現(xiàn)基因的插入或??突變＠５９］。如果在同一系統(tǒng)中設計兩個ｓｐａｃｅｒ就可特異刪除某一片段，刪除片??段的長度范圍可在２０?ｂｐ至８２．８?ｋｂ［６Ｇ，６Ｉ］。??ｓｇＲＮＡ??＿?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｔｏ??＾％／ａｓ９??Ｍａｔｃｈｉｎｇ?ＤＮＡ?邏?ＰＡＭ??ｔａｒｇｅｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?．?ｓｅｑｕｅｎｃｅ??圖１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９示意圖丨３３】??Ｆｉｇ．１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??１．３．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術在鏈霉菌基因組編輯中的應用??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術在鏈霉菌中的應用相關文獻主要集中在近３年，研宄對象??包括研宄背景較為清楚的模式菌株
【參考文獻】：
期刊論文
[1]鏈霉菌次級代謝物及其應用研究進展[J]. 代芳平,李師翁. 生物技術通報. 2014(03)
[2]鏈霉菌無痕敲除方法研究進展[J]. 谷燕燕,耿偉濤,宋存江. 生物工程學報. 2013(08)
[3]放線菌野生株代謝功能的核糖體工程改造與新產抗腫瘤活性產物研究[J]. 韓曉,崔承彬,韓小賢,李長偉,楊明. 國際藥學研究雜志. 2009(06)
[4]微生物核糖體工程研究進展[J]. 謝庶潔,肖靜,徐俊. 微生物學報. 2009(08)
[5]鏈霉菌次級代謝研究進展[J]. 李歐,繆克排. 中國抗生素雜志. 2005(11)
[6]鏈霉菌次級代謝調控機制進展[J]. 張艷娟,洪斌. 中國生物工程雜志. 2004(12)
博士論文
[1]十一烷基靈菌紅素（metacycloprodigiosin）的提取分離及抗腫瘤活性研究[D]. 李雪萍.中國海洋大學 2009
碩士論文
[1]兩株鏈霉菌次級代謝產物研究[D]. 賴珍珠.廣州醫(yī)科大學 2017
[2]鏈霉菌抗生素生物合成基因簇中調控基因作用機制的初步研究[D]. 黃璐瑤.華中師范大學 2014
[3]海洋來源產木聚糖酶的鏈霉菌菌種篩選與代謝工程改造[D]. 劉卓.大連理工大學 2013
本文編號：3585597
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