本文關(guān)鍵詞：表達(dá)禽流感病毒HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒誘導(dǎo)特異性快速免疫保護(hù)機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：H5N1亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科有囊膜多形態(tài)單股負(fù)鏈RNA病毒。該病毒嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展和人類健康。AIV通過結(jié)構(gòu)蛋白識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體并與受體結(jié)合感染細(xì)胞,其中HA蛋白作為最重要的保護(hù)性抗原,已成為各類抗流感疫苗研究的靶蛋白。前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVus78Ha株,免疫鴨后可在鴨體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)同源AIV堅(jiān)固且快速的免疫保護(hù),但其免疫機(jī)制仍不清楚。在高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染宿主細(xì)胞的過程中,HA蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū)對(duì)其活性和表達(dá)都存在影響。為研究抗原不同遞呈形式對(duì)疫苗保護(hù)效果的影響,本試驗(yàn)首先利用RedE/T同源重組技術(shù)和Gateway LR克隆技術(shù),將以SV40作為啟動(dòng)子的不同形式的HA基因編碼序列插入DEV復(fù)制非必須區(qū)US7和US8之間,隨后分別構(gòu)建了表達(dá)缺失HA基因信號(hào)肽的重組DEV(rDEV-PK)和缺失HA基因跨膜區(qū)的重組DEV(rDEV-PSM);重組病毒拯救成功后,分別以rDEVus78Ha、rDEV-PK和rDEV-PSM對(duì)三周齡SPF鴨進(jìn)行免疫,于免疫后3d和7d進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),對(duì)重組病毒rDEV-PK和rDEV-PSM的免疫保護(hù)能力進(jìn)行評(píng)估。為研究rDEVus78Ha能夠提供特異性快速免疫保護(hù)的機(jī)制,用其免疫三周齡SPF鴨,同時(shí)設(shè)置禽流感滅活疫苗Re-5株和PBS對(duì)照組,于免疫后1d、3d、5d、7d、14d分別采集脾臟、法氏囊、氣管洗液、唾液和淚液,分離外周血淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞和血清,然后利用熒光定量PCR、流式細(xì)胞檢測(cè)和間接ELISA等技術(shù)對(duì)重組DEV免疫后鴨體內(nèi)的天然免疫和獲得性免疫情況進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明:成功拯救了兩株重組病毒rDEV-PK和rDEV-PSM,缺失HA基因信號(hào)肽的rDEV-PK表達(dá)的HA蛋白不能正常地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上而在感染細(xì)胞內(nèi)積聚,缺失HA基因跨膜區(qū)的重組rDEV-PSM表達(dá)的HA蛋白被分泌到細(xì)胞外,且HA基因信號(hào)肽或跨膜區(qū)的缺失均不影響重組病毒的復(fù)制;但重組病毒rDEV-PK和rDEV-PSM并不能誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生對(duì)同源性HPAIV的特異性快速免疫保護(hù)作用;包含HA蛋白完整信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列的重組病毒rDEVus78HA株免疫鴨后能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)細(xì)胞因子IFN-γ、Granzyme-A的表達(dá),增強(qiáng)淋巴細(xì)胞刺激增殖能力,誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的CD4+T細(xì)胞,提高了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。本研究表明,HA蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū)均是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性快速免疫應(yīng)答的必須區(qū)域;而增強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可能是rDEVus78Ha能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性快速免疫保護(hù)的關(guān)鍵因素。這為特異性快速免疫機(jī)制的研究和未來快速免疫疫苗的研究提供了參考和研究基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：高致病性禽流感 重組鴨病毒性腸炎病毒 HA蛋白 熒光定量PCR 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Summary5-11
• 第一章緒論11-20
• 1.禽流感病毒概述12-17
• 1.1 流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展12-13
• 1.2 H5N1亞型禽流感13-14
• 1.3 HA蛋白14-15
• 1.4 HA蛋白的信號(hào)肽與跨膜區(qū)15-16
• 1.5 禽流感病毒疫苗研究進(jìn)展16-17
• 2.鴨病毒性腸炎病毒概述17-20
• 2.1 鴨病毒性腸炎病毒研究進(jìn)展17-18
• 2.2 鴨病毒性腸炎病毒載體研究進(jìn)展18-20
• 第二章表達(dá)H5亞型禽流感病毒不同形式HA基因重組鴨病毒性腸炎病毒的構(gòu)建與鑒定20-38
• 1．材料與方法20-30
• 1.1 病毒株、重組質(zhì)粒及細(xì)胞20
• 1.2 試劑與耗材20-21
• 1.3 主要儀器21-22
• 1.4 試驗(yàn)動(dòng)物22
• 1.5 引物的設(shè)計(jì)合成22
• 1.6 表達(dá)缺失信號(hào)肽或跨膜區(qū)AIV HA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建22-25
• 1.7 重組粘粒T-us78HApk和T-us78HApsm的構(gòu)建25
• 1.8 重組病毒的拯救25-28
• 1.9 重組病毒的鑒定28-29
• 1.10 重組病毒一步生長曲線的測(cè)定29
• 1.11 重組病毒的攻毒保護(hù)效力評(píng)估29-30
• 2．結(jié)果30-36
• 2.1 不同區(qū)域HA基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定30-31
• 2.2 重組病毒的成功拯救31-32
• 2.3 重組病毒的PCR鑒定32
• 2.4 重組病毒的IFA鑒定32-33
• 2.5 重組病毒的Western blot鑒定33-34
• 2.6 重組病毒的生長動(dòng)力學(xué)曲線34
• 2.7 重組病毒的攻毒保護(hù)效力評(píng)估34-36
• 3．討論36-38
• 第三章禽流感重組鴨病毒性腸炎病毒載體活疫苗在鴨體內(nèi)誘導(dǎo)天然免疫情況研究38-51
• 1.材料與方法38-44
• 1.1 疫苗38
• 1.2 主要試劑38
• 1.3 主要儀器設(shè)備38-39
• 1.4 試驗(yàn)動(dòng)物39
• 1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)39
• 1.6 引物設(shè)計(jì)39
• 1.7 組織總RNA提取39-41
• 1.8 反轉(zhuǎn)錄41-42
• 1.9 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備42-43
• 1.10 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的測(cè)定及拷貝數(shù)的計(jì)算43
• 1.11 熒光定量PCR43-44
• 1.12 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制44
• 1.13 方法性能評(píng)估44
• 1.14 細(xì)胞因子的表達(dá)定量44
• 2.結(jié)果44-48
• 2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制44-46
• 2.2 性能評(píng)估46-47
• 2.3 細(xì)胞因子mRNA表達(dá)定量47-48
• 3.討論48-51
• 第四章禽流感重組鴨病毒性腸炎病毒載體活疫苗在鴨體內(nèi)誘導(dǎo)獲得性免疫情況研究51-56
• 1.材料與方法51-52
• 1.1 疫苗及動(dòng)物51
• 1.2 主要試劑51-52
• 1.3 主要儀器設(shè)備52
• 1.4 方法52
• 2 結(jié)果52-55
• 2.1 淋巴細(xì)胞刺激增殖指數(shù)（SI）測(cè)定結(jié)果52-53
• 2.2 CD~(4+)淋巴細(xì)胞測(cè)定結(jié)果53-54
• 2.3 間接ELISA檢測(cè)HA特異性抗體結(jié)果54-55
• 3．討論55-56
• 第五章全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 致謝65-66
• 作者簡(jiǎn)介66-67
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介67-68

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本文編號(hào)：358437