枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生物安全性高、遺傳背景清晰、蛋白分泌能力強(qiáng)等突出特點(diǎn),廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)和表達(dá)各種外源蛋白。本研究旨在利用無痕敲除技術(shù)和胞外蛋白譜構(gòu)建無抗性標(biāo)記的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達(dá)宿主、采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和信號(hào)肽庫篩選挖掘最優(yōu)表達(dá)元件以及分析Sec分泌途徑中折疊相關(guān)基因功能的研究,建立具有應(yīng)用潛力的枯草芽孢桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)。本文先通過溫敏型質(zhì)粒pKS2無痕敲除體系失活了B.subtilis ATCC 6051的八種蛋白酶編碼基因（nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA）,一個(gè)芽孢形成因子F編碼基因spollAC和surfactin合成酶編碼基因srfAC,成功構(gòu)建了B.subtilis無抗性標(biāo)記、不產(chǎn)孢子且副產(chǎn)物少的宿主;并以B.subtilis 168為參照做相對(duì)應(yīng)的研究。將茂原鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原（proMTG）和嗜熱地芽孢桿菌（Geobacillus kaustophilus）來源的耐熱半乳糖苷酶（BgaB）驗(yàn)證表達(dá)宿主的重組蛋白可行性,菌株B.su... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：179 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 枯草芽孢桿菌概述
    1.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)概述
        1.2.1 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)
        1.2.2 枯草芽胞桿菌表達(dá)宿主
        1.2.3 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)的載體
        1.2.4 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)的元件
        1.2.5 枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌機(jī)制
        1.2.6 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.2.7 存在的問題
    1.3 本論文立題依據(jù)與研究內(nèi)容
        1.3.1 立題依據(jù)及研究意義
        1.3.2 主要研究內(nèi)容
        1.3.3 技術(shù)路線
第二章 B.subtilisATCC6051宿主的構(gòu)建及其表達(dá)特性、胞外蛋白組學(xué)的研究
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.2.1 主要儀器和設(shè)備
        2.2.2 菌種和質(zhì)粒
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 所用引物序列
        2.2.5 細(xì)菌培養(yǎng)基
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)
        2.3.2 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化
        2.3.4 枯草芽孢桿菌基因缺陷菌株的構(gòu)建
        2.3.5 枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.6 枯草芽孢桿菌基因缺陷株的胞外分泌蛋白分析
        2.3.7 蛋白表達(dá)重組菌株的培養(yǎng)
        2.3.8 酶活測(cè)定方法
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 B.subtilisATCC6051生長特性及宿主的構(gòu)建
        2.4.2 B.subtilisATCC6051宿主胞外分泌蛋白譜的研究
        2.4.3 B.subtilisATCC6051宿主表達(dá)特性的研究
    2.5 本章小結(jié)
第三章 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)芽孢桿菌中不同類型啟動(dòng)子的研究
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 主要儀器和設(shè)備
        3.2.2 菌種和質(zhì)粒
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 細(xì)菌培養(yǎng)基
        3.2.5 所用引物序列
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)
        3.3.2 RNA-seq樣品的制備
        3.3.3 cDNA建庫及測(cè)序
        3.3.4 RNA-Seq數(shù)據(jù)的拼接及基因表達(dá)情況
        3.3.5 RNA-seq生物信息學(xué)分析
        3.3.6 質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.7 啟動(dòng)子篩選菌株的構(gòu)建及培養(yǎng)
        3.3.8 啟動(dòng)子的序列分析
        3.3.9 強(qiáng)啟動(dòng)子的應(yīng)用
        3.3.10 酶活測(cè)定方法
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 RNA樣品的制備與分析
        3.4.2 基于RNA-Seq數(shù)據(jù)對(duì)三株芽孢桿菌的分析
        3.4.3 芽孢桿菌不同類型啟動(dòng)子的研究
        3.4.4 強(qiáng)啟動(dòng)子的重組表達(dá)效率的研究
    3.5 本章小結(jié)
第四章 Sec途徑類型信號(hào)肽的分泌效率研究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        4.2.1 主要儀器設(shè)備
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)基
        4.2.4 菌種和質(zhì)粒
        4.2.5 所用引物序列
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 菌體的培養(yǎng)
        4.3.2 質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 信號(hào)肽重組菌株的構(gòu)建
        4.3.4 酶活測(cè)定方法
        4.3.5 信號(hào)肽的分析
        4.3.6 高效分泌信號(hào)肽的應(yīng)用
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 枯草芽孢桿菌信號(hào)肽篩選載體的構(gòu)建
        4.4.2 Sec類型信號(hào)肽對(duì)BgaB分泌效率的研究
        4.4.3 信號(hào)肽LytF對(duì)不同外源蛋白分泌效率的研究
        4.4.4 Sec途徑類型信號(hào)肽對(duì)proMTG分泌效率的研究
        4.4.5 Sec類型信號(hào)肽對(duì)AmyM分泌效率的研究
        4.4.6 信號(hào)肽AprE對(duì)不同外源蛋白分泌效率的研究
    4.5 本章小結(jié)
第五章 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的應(yīng)用研究
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        5.2.1 主要儀器設(shè)備
        5.2.2 菌種和質(zhì)粒
        5.2.3 主要試劑
        5.2.4 培養(yǎng)基和溶液的配制
        5.2.5 所用引物序列
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 菌體的培養(yǎng)
        5.3.2 質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3.3 重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
        5.3.4 發(fā)酵液中葡萄糖含量的測(cè)定
        5.3.5 胞外總蛋白分泌量的檢測(cè)
        5.3.6 重組蛋白樣品的親和層析純化
        5.3.7 酶活測(cè)定方法
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.4.2 proMTG高效表達(dá)系統(tǒng)重組菌在搖瓶發(fā)酵的研究
        5.4.3 proMTG高效表達(dá)系統(tǒng)重組菌在5L發(fā)酵罐培養(yǎng)的研究
        5.4.4 proMTG高效表達(dá)系統(tǒng)重組菌的SDS-PAGE分析
    5.5 本章小結(jié)
第六章 Sec分泌途徑中折疊相關(guān)功能基因研究
    6.1 引言
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        6.2.1 主要儀器設(shè)備
        6.2.2 菌種和質(zhì)粒
        6.2.3 主要試劑
        6.2.4 細(xì)菌培養(yǎng)基
        6.2.5 所用引物序列
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 菌體的培養(yǎng)
        6.3.2 基因序列預(yù)測(cè)及分析
        6.3.3 質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.3.4 重組菌的構(gòu)建
        6.3.5 重組菌的培養(yǎng)和酶活測(cè)定方法
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 Sec分泌途徑基因改造工程菌株的構(gòu)建
        6.4.2 Sec分泌途徑折疊相關(guān)基因改造的研究
        6.4.3 三個(gè)不同來源PrsA蛋白與proMTG共表達(dá)的研究
        6.4.4 B.megateriumPrsA蛋白與AmyM共表達(dá)的研究
    6.5 本章小結(jié)
結(jié)論和展望
    結(jié)論
    本論文創(chuàng)新點(diǎn)
    展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]枯草芽孢桿菌對(duì)桑椹采后致腐微生物的抑菌作用[J]. 陳成,方銀,金超,李少輝,陳會(huì)娟,賈俊強(qiáng),桂仲爭.  蠶業(yè)科學(xué). 2016(01)
[2]基因在分離重組中的熵增與制約[J]. 陳奇,韋文惠,李大林.  上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版). 2007(01)
[3]枯草芽孢桿菌抗菌蛋白X98Ⅲ的純化與性質(zhì)[J]. 謝棟,彭憬,王津紅,胡劍,王岳五.  微生物學(xué)報(bào). 1998(01)
[4]基因工程原理[J]. 紀(jì)實(shí).  生物工程進(jìn)展. 1990(02)

博士論文
[1]Bacillus subtilis基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及其在發(fā)酵工程中的應(yīng)用[D]. 楊森.江南大學(xué) 2017
[2]枯草芽孢桿菌及鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用研究[D]. 關(guān)成冉.江南大學(xué) 2016
[3]解淀粉芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其表達(dá)元件的挖掘與應(yīng)用[D]. 廖瑜玲.華南理工大學(xué) 2016
[4]枯草芽孢桿菌中Sec分泌途徑底物特性及非經(jīng)典分泌途徑的研究[D]. 王光強(qiáng).江南大學(xué) 2013
[5]枯草芽孢桿菌關(guān)鍵遺傳調(diào)控元件及表達(dá)系統(tǒng)的研究[D]. 楊明明.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[6]基于全基因組測(cè)序和系統(tǒng)生物學(xué)分析的鳥苷工業(yè)生產(chǎn)菌分子育種研究[D]. 楊慧林.華南理工大學(xué) 2012
[7]枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和分泌表達(dá)研究[D]. 夏雨.江南大學(xué) 2007

碩士論文
[1]嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶的分子改造及高效表達(dá)[D]. 孫燁橙.江南大學(xué) 2016
[2]α-淀粉酶的異源表達(dá)、調(diào)控元件優(yōu)化和分泌瓶頸鑒定[D]. 陳景奇.天津大學(xué) 2015
[3]茂源鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的異源表達(dá)研究[D]. 王坤.華南理工大學(xué) 2013
[4]外源木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中信號(hào)肽篩選[D]. 范鑫.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2011
[5]枯草芽孢桿菌信號(hào)肽篩選載體的構(gòu)建及木聚糖酶基因（xynA）的表達(dá)[D]. 段春燕.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010



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