枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有生物安全性高、遺傳背景清晰、蛋白分泌能力強等突出特點,廣泛地應用于生產(chǎn)和表達各種外源蛋白。本研究旨在利用無痕敲除技術和胞外蛋白譜構建無抗性標記的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達宿主、采用轉錄組學技術和信號肽庫篩選挖掘最優(yōu)表達元件以及分析Sec分泌途徑中折疊相關基因功能的研究,建立具有應用潛力的枯草芽孢桿菌高效表達系統(tǒng)。本文先通過溫敏型質(zhì)粒pKS2無痕敲除體系失活了B.subtilis ATCC 6051的八種蛋白酶編碼基因（nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA）,一個芽孢形成因子F編碼基因spollAC和surfactin合成酶編碼基因srfAC,成功構建了B.subtilis無抗性標記、不產(chǎn)孢子且副產(chǎn)物少的宿主;并以B.subtilis 168為參照做相對應的研究。將茂原鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）來源的轉谷氨酰胺酶酶原（proMTG）和嗜熱地芽孢桿菌（Geobacillus kaustophilus）來源的耐熱半乳糖苷酶（BgaB）驗證表達宿主的重組蛋白可行性,菌株B.su... 

【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 枯草芽孢桿菌概述
    1.2 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)概述
        1.2.1 枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)的特點
        1.2.2 枯草芽胞桿菌表達宿主
        1.2.3 枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)的載體
        1.2.4 枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)的元件
        1.2.5 枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌機制
        1.2.6 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的應用
        1.2.7 存在的問題
    1.3 本論文立題依據(jù)與研究內(nèi)容
        1.3.1 立題依據(jù)及研究意義
        1.3.2 主要研究內(nèi)容
        1.3.3 技術路線
第二章 B.subtilisATCC6051宿主的構建及其表達特性、胞外蛋白組學的研究
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與方法
        2.2.1 主要儀器和設備
        2.2.2 菌種和質(zhì)粒
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 所用引物序列
        2.2.5 細菌培養(yǎng)基
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細菌的培養(yǎng)
        2.3.2 質(zhì)粒的構建
        2.3.3 枯草芽孢桿菌的轉化
        2.3.4 枯草芽孢桿菌基因缺陷菌株的構建
        2.3.5 枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.6 枯草芽孢桿菌基因缺陷株的胞外分泌蛋白分析
        2.3.7 蛋白表達重組菌株的培養(yǎng)
        2.3.8 酶活測定方法
    2.4 結果與討論
        2.4.1 B.subtilisATCC6051生長特性及宿主的構建
        2.4.2 B.subtilisATCC6051宿主胞外分泌蛋白譜的研究
        2.4.3 B.subtilisATCC6051宿主表達特性的研究
    2.5 本章小結
第三章 基于轉錄組數(shù)據(jù)對芽孢桿菌中不同類型啟動子的研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與方法
        3.2.1 主要儀器和設備
        3.2.2 菌種和質(zhì)粒
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 細菌培養(yǎng)基
        3.2.5 所用引物序列
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細菌的培養(yǎng)
        3.3.2 RNA-seq樣品的制備
        3.3.3 cDNA建庫及測序
        3.3.4 RNA-Seq數(shù)據(jù)的拼接及基因表達情況
        3.3.5 RNA-seq生物信息學分析
        3.3.6 質(zhì)粒的構建
        3.3.7 啟動子篩選菌株的構建及培養(yǎng)
        3.3.8 啟動子的序列分析
        3.3.9 強啟動子的應用
        3.3.10 酶活測定方法
    3.4 結果與討論
        3.4.1 RNA樣品的制備與分析
        3.4.2 基于RNA-Seq數(shù)據(jù)對三株芽孢桿菌的分析
        3.4.3 芽孢桿菌不同類型啟動子的研究
        3.4.4 強啟動子的重組表達效率的研究
    3.5 本章小結
第四章 Sec途徑類型信號肽的分泌效率研究
    4.1 引言
    4.2 實驗儀器和材料
        4.2.1 主要儀器設備
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 細菌培養(yǎng)基
        4.2.4 菌種和質(zhì)粒
        4.2.5 所用引物序列
    4.3 實驗方法
        4.3.1 菌體的培養(yǎng)
        4.3.2 質(zhì)粒的構建
        4.3.3 信號肽重組菌株的構建
        4.3.4 酶活測定方法
        4.3.5 信號肽的分析
        4.3.6 高效分泌信號肽的應用
    4.4 結果與討論
        4.4.1 枯草芽孢桿菌信號肽篩選載體的構建
        4.4.2 Sec類型信號肽對BgaB分泌效率的研究
        4.4.3 信號肽LytF對不同外源蛋白分泌效率的研究
        4.4.4 Sec途徑類型信號肽對proMTG分泌效率的研究
        4.4.5 Sec類型信號肽對AmyM分泌效率的研究
        4.4.6 信號肽AprE對不同外源蛋白分泌效率的研究
    4.5 本章小結
第五章 轉谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢桿菌中高效表達的應用研究
    5.1 引言
    5.2 實驗材料與方法
        5.2.1 主要儀器設備
        5.2.2 菌種和質(zhì)粒
        5.2.3 主要試劑
        5.2.4 培養(yǎng)基和溶液的配制
        5.2.5 所用引物序列
    5.3 實驗方法
        5.3.1 菌體的培養(yǎng)
        5.3.2 質(zhì)粒的構建
        5.3.3 重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
        5.3.4 發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定
        5.3.5 胞外總蛋白分泌量的檢測
        5.3.6 重組蛋白樣品的親和層析純化
        5.3.7 酶活測定方法
    5.4 結果與討論
        5.4.1 重組表達載體的構建
        5.4.2 proMTG高效表達系統(tǒng)重組菌在搖瓶發(fā)酵的研究
        5.4.3 proMTG高效表達系統(tǒng)重組菌在5L發(fā)酵罐培養(yǎng)的研究
        5.4.4 proMTG高效表達系統(tǒng)重組菌的SDS-PAGE分析
    5.5 本章小結
第六章 Sec分泌途徑中折疊相關功能基因研究
    6.1 引言
    6.2 實驗材料與方法
        6.2.1 主要儀器設備
        6.2.2 菌種和質(zhì)粒
        6.2.3 主要試劑
        6.2.4 細菌培養(yǎng)基
        6.2.5 所用引物序列
    6.3 實驗方法
        6.3.1 菌體的培養(yǎng)
        6.3.2 基因序列預測及分析
        6.3.3 質(zhì)粒的構建
        6.3.4 重組菌的構建
        6.3.5 重組菌的培養(yǎng)和酶活測定方法
    6.4 結果與討論
        6.4.1 Sec分泌途徑基因改造工程菌株的構建
        6.4.2 Sec分泌途徑折疊相關基因改造的研究
        6.4.3 三個不同來源PrsA蛋白與proMTG共表達的研究
        6.4.4 B.megateriumPrsA蛋白與AmyM共表達的研究
    6.5 本章小結
結論和展望
    結論
    本論文創(chuàng)新點
    展望
參考文獻
附錄
攻讀博士學位期間取得的研究成果
致謝
附件


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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[3]解淀粉芽孢桿菌轉錄組學及其表達元件的挖掘與應用[D]. 廖瑜玲.華南理工大學 2016
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[6]基于全基因組測序和系統(tǒng)生物學分析的鳥苷工業(yè)生產(chǎn)菌分子育種研究[D]. 楊慧林.華南理工大學 2012
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碩士論文
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[2]α-淀粉酶的異源表達、調(diào)控元件優(yōu)化和分泌瓶頸鑒定[D]. 陳景奇.天津大學 2015
[3]茂源鏈霉菌轉谷氨酰胺酶的異源表達研究[D]. 王坤.華南理工大學 2013
[4]外源木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中信號肽篩選[D]. 范鑫.西北農(nóng)林科技大學 2011
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本文編號：3583849