【目的】以前期通過穗發(fā)育芯片篩選到一個(gè)水稻Dof家族轉(zhuǎn)錄因子Os Dof6為研究對(duì)象,進(jìn)一步探究Os Dof6的表達(dá)模式與生物學(xué)功能�！痉椒ā繉�(duì)Os Dof6的基因、蛋白及啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯,通過實(shí)時(shí)定量PCR和亞細(xì)胞定位技術(shù)分析該基因的表達(dá)模式。【結(jié)果】對(duì)該基因的啟動(dòng)子序列分析表明,該基因啟動(dòng)子中存在大量與光響應(yīng)、激素響應(yīng)及脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件。利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了2種不同突變類型的功能缺失突變體9522Dof6-3和9522Dof6-4。對(duì)突變體T1株系進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn),相較于對(duì)照,兩種突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段分蘗數(shù)明顯降低,轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)階段后,兩種突變體的抽穗時(shí)間推遲約3d。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示Os Dof6在水稻根、莖、葉和穗中均有不同程度的表達(dá),在穗發(fā)育后期相對(duì)表達(dá)量明顯提高;通過亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)OsDof6定位于細(xì)胞核。【結(jié)論】初步判斷Os Dof6基因會(huì)影響水稻分蘗數(shù)與抽穗期。 

【文章來源】：中國(guó)水稻科學(xué). 2020,34(05)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

Os Dof6基因時(shí)空表達(dá)分析

圖2 Os Dof6基因時(shí)空表達(dá)分析通過同源重組的方式，將Os Dof6的c DNA序列（不包含終止密碼子TAA）整合到pCAMBIA1305-GFP載體上，獲得pCAMBIA1305-Dof6-GFP植物融合表達(dá)載體，將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并侵染煙草葉片表皮細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察Dof6-GFP融合蛋白的熒光信號(hào)（圖3),Dof6-GFP融合蛋白主要定位在細(xì)胞核中，而在空載對(duì)照的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均能檢測(cè)到熒光信號(hào)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Os Dof6特異定位于細(xì)胞核中。

為了進(jìn)一步研究Os Dof6在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，構(gòu)建了Os Dof6基因編輯載體。經(jīng)過PCR鑒定與序列比對(duì)，OsDof6的靶位點(diǎn)成功構(gòu)建入pYLCRISPR/Cas9-MT載體中，獲得了植物表達(dá)載體p YLCRISPR/Cas9-MT-Dof6（圖4-A）。將該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻9522愈傷組織并鑒定，共獲得4株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株9522Dof6-1、9522Dof6-2、9522Dof6-3和9522Dof6-4，其中9522Dof6-2、9522Dof6-3和9522Dof6-4在靶位點(diǎn)處出現(xiàn)突變，9522Dof6-1未發(fā)生突變。9522Dof6-2和9522Dof6-3具有相同的突變類型，該突變使得原基因序列的第62～69 bp共8個(gè)堿基缺失，直接導(dǎo)致閱讀框移碼致使翻譯提前終止，破壞了Dof蛋白的結(jié)構(gòu)，形成了一個(gè)與Dof蛋白完全不同的108 aa的蛋白（圖4-D）。9522Dof6-4使得原基因序列第11～313 bp共303個(gè)堿基丟失，即氨基酸序列第4～104 aa共100個(gè)氨基酸缺失，該突變使Dof保守結(jié)構(gòu)域完全缺失。圖5 野生型9522與Dof6突變體的表型比較

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻OsD1基因的敲除及其功能初步探究[D]. 鄧堯.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3577437