發(fā)布時間：2022-01-07 06:12

　　本實驗室先前的研究表明,利用釀酒酵母MF-α信號肽和增強型綠色熒光蛋白（EGFP）及人源金屬硫蛋白（MT3）編碼序列構建融合基因,在轉基因植物中表達重組蛋白MF-α-EGFP-MT3,MF-α可介導EGFP-MT3分泌到植物體外,增加轉基因植物對部分重金屬的抗性。植物和動物的金屬硫蛋白結構不同,水稻擁有龐大的金屬硫蛋白基因家族（編碼11種金屬硫蛋白,OsMTs）,海篷子（Salicornia europaea L.）有耐鹽堿、耐金屬的超強能力,因此本研究論文嘗試利用MF-α的介導作用在轉基因植物中過量表達分泌型水稻金屬硫蛋白基因OsMT-I-2b和海篷子金屬硫蛋白基因SbMT-2。為了便于表達蛋白的檢測,將這兩個蛋白基因的編碼區(qū)與報告基因EGFP融合表達,通過生物公司合成SbMT2和OsMT2與EGFP融合基因序列:EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2,利用Gateway技術構建兩個含有α因子信號肽（MF-α）的植物表達載體pK-MF-α-EGFP-SbMT2和pK-MF-α-EGFP-OsMT2,轉化煙草和天竺葵,獲得相應的轉基因株系,考察轉基因株系對重金屬的富集能力和抗性,進... 

【文章來源】：昆明理工大學云南省

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

pUC57-SbMT2載體圖譜

昆明理工大學碩士學位論文28圖2.2Cd2+標準曲線Fig.2.2Cd2+standardcurve2.1.10.2煙草植株各部分鎘含量測定溶液中Cd2+的檢測：吸取100μL處理液與100μLB-R溶液混合（1：1）。葉表面：將葉片平鋪與培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入10mLB-R溶液，為放置溶液揮發(fā)使用保鮮膜封閉，每隔1～2min將葉片翻轉，保證葉片表面的Cd2+析出，10min后收集溶液，洗滌葉片之前，將葉片放于A4紙上畫出輪廓，剪下，稱量其重量，剪一張已知面積的A4紙，通過比例間接計算葉片的表面積，計算單位面積的Cd2+含量。根、莖、葉：去離子水清洗表面吸干水分，液氮研磨滴加1mLB-R溶液抽提，震蕩離心，收集上清液。2.1.11植物樣品中MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2蛋白的測定2.1.11.1EGFP蛋白標準曲線的測定實驗室，蛋白表達的測定常用WesternBlot分析技術，但這一方法存在一些弊端，比如操作較為繁瑣，需要染色、脫色轉膜等，而且在檢測過程中蛋白需求量有較高要求。有人運用電化學免疫方法來分析蛋白，如制備甲胎蛋白免疫傳感器，在腫瘤標志物的測定等方向研究較廣[126]，此方法檢測速度較快、靈敏度較高。參考李勝昔[127]等人的方法，采用物理組裝將EGFP兔抗（捕獲探針）吸附在印刷電極表面，隨后將待檢測物即待檢測的蛋白物理吸附在其表面，然后連接信號探針（將EGFP兔抗采用特異性結合的方法進行生物素標記），SA-HRP（辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素）會和生物素親和連接，在印刷電極表面結合，使

昆明理工大學碩士學位論文29用電化學工作站檢測，辣根過氧化物酶催化底物的氧化還原電流得以檢測。實驗原理見圖3.4。圖2.3絲網(wǎng)印刷電極檢測蛋白含量原理示意圖Fig.2.3schematicdiagramofscreenprintingelectrodedetectionproteincontentSchematicdiagramofscreenprintedelectrodedetectionprotein生物素標記EGFP兔抗的獲得（1）標記方法a.將5mgBiotion-XX-NHS溶解在250μLDMF中；b.將EGFP兔抗蛋白溶解在0.01mol/L的磷酸緩沖液（PBS）中；c.Biotin與EGFP兔抗蛋白按照1:1體積比例混合（由于需要標記的EGFP兔抗100μL，故此處的Biotin與EGFP抗體蛋白分別為60μL，以免在過凝膠柱的時候量不足，影響實驗結果），并且在室溫下超聲震蕩1h；d.反應液過凝膠柱，以0.01mol/LpH=7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集蛋白部分，為不含游離Biotin的結合物。（2）凝膠柱的使用凝膠柱大約有3mL的凝膠體積，凝膠的量限制了可被純化的空間，所以，最多100μL的蛋白液加至柱床。a.首先，為使凝膠沉積（驅除氣泡），需要加入一定體積的磷酸緩沖液（PBS），一般與柱床體積的量一致，如2mL，輕輕晃動柱子，使凝膠懸浮，而后，摘掉柱底的小塞，以及柱頂小塞，在大氣壓強的作用下，不至于產(chǎn)生大量氣泡，讓液

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Response of Platanus orientalis leaves to urban pollution by heavy metals[J]. Esmaiel Khosropour,Pedram Attarod,Anoushirvan Shirvany,Thomas Grant Pypker,Vilma Bayramzadeh,Leila Hakimi,Mazaher Moeinaddini.  Journal of Forestry Research. 2019(04)
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[3]高靈敏甲胎蛋白夾心免疫傳感器的制備[J]. 王雪,李鵬君,邱萍,王小磊.  分析化學. 2017(08)
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[9]RNA提取過程中DEPC的毒性[J]. 王長曄.  天津科技. 2008(05)
[10]大蒜金屬硫蛋白家族新成員AsMT2b在鎘離子脅迫下的功能分析[J]. 張海燕,徐文忠,戴文韜,何振艷,麻密.  科學通報. 2006(03)

博士論文
[1]電化學免疫傳感器在腫瘤標志物檢測中的應用研究[D]. 李勝昔.復旦大學 2012
[2]苧麻對重金屬吸收和積累特征及鎘脅迫響應基因表達研究[D]. 佘瑋.湖南農(nóng)業(yè)大學 2010

碩士論文
[1]快速檢測食品中痕量鉛、鎘、銅的電化學傳感方法的研究[D]. 翁芝瑩.上海交通大學 2012



本文編號：3573979