木質(zhì)纖維素是生物質(zhì)能源的重要表現(xiàn)形式,具有儲(chǔ)量豐富,可持續(xù)再生,環(huán)境友好等特點(diǎn)。植物細(xì)胞壁堅(jiān)固的抗降解屏障是限制木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化利用的關(guān)鍵因子。阿魏酸是半纖維素分子之間以及半纖維素與木質(zhì)素分子之間共價(jià)交聯(lián)的橋梁,在植物細(xì)胞壁復(fù)雜的高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成中起關(guān)鍵作用,從而阻礙降解酶對(duì)細(xì)胞壁的降解。微生物源的阿魏酸酯酶基因在植物中的表達(dá)可以有效提高細(xì)胞壁的降解轉(zhuǎn)化效率,但常溫酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中表達(dá)酶活性,對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有干擾和毒害作用。本文采用熱纖梭菌來源的嗜熱阿魏酸酯酶基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,實(shí)現(xiàn)植物生長(zhǎng)發(fā)育安全和細(xì)胞壁易降解轉(zhuǎn)化的雙重目標(biāo),其主要研究成果如下:1)為提高FAE酶在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率,首先優(yōu)化了該基因的密碼子,替換稀有密碼子,提高GC%等。分別構(gòu)建了該嗜熱FAE基因在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體和線粒體中定位表達(dá)的一系列重組基因植物表達(dá)載體pBINPLUS-ImpactVectors-FAEx。2)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,采用PCR的方法篩選鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,成功篩選到FAE1（胞質(zhì)表達(dá)）、FAE2（質(zhì)外體表達(dá)）、FAE4（葉綠體表達(dá)）和FAE5（線粒... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

禾本科植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文7圖1.2 禾本科植物細(xì)胞壁半纖維素的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1.2 Molecular structure of hemicellulose in the cell wall of gramineous plants改繪自Wong (2005)FA,阿魏酸;Xyl,木糖,Ara,阿拉伯糖;AX,阿拉伯木聚糖;GAX,阿拉伯糖葡糖醛酸木聚糖;GlcA,葡糖醛酸;Lignin,木質(zhì)素. 箭頭所示位置為阿魏酸酯酶的水解位點(diǎn).1.3 木質(zhì)纖維素降解酶基因在植物細(xì)胞中的異源表達(dá)細(xì)胞壁降解，是將各種細(xì)胞壁組分分解成較小的組成單元。細(xì)胞壁降解需要幾個(gè)步驟：去除或分解木質(zhì)素和其他可能抑制酶促反應(yīng)并阻止纖維素酶進(jìn)入纖維素的物質(zhì)；去除或水解半纖維素以使纖維素暴露于纖維素酶；纖維素酶將纖維素水解成葡萄糖。據(jù)報(bào)道，外源木質(zhì)纖維素降解酶基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)可以提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率，可以為能源植物、牧草和農(nóng)作物秸稈的高效資源化利用提供新的思路。近年來，越來越多科研人員將外源的木質(zhì)纖維素降解酶在植物細(xì)胞中異源表達(dá)，利用這些植物作為生物反應(yīng)器，使木質(zhì)纖維素酶在植物生長(zhǎng)過程中大量表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)積累。收獲后將生物質(zhì)粉碎、預(yù)處理，再進(jìn)一步利用自身表達(dá)的酶發(fā)酵，減少添加外源木質(zhì)纖維素酶，以提高植物降解效率，進(jìn)一步用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

占?jí)A基總數(shù)的26.60%，密碼子改變262個(gè)，占密碼子總數(shù)66.16%（圖2.4）。2.3.2 植物高效表達(dá)載體的構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳（圖2.5）顯示，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NocI及NotI的雙酶切，PUC57-FAE1克隆載體有兩條大小不同的DNA片段，其中FAE基因長(zhǎng)1188bp。圖2.5 嗜熱阿魏酸酯酶FAE基因序列的酶切結(jié)果Fig. 2.5 Thedigestion results of the FAEsequences from C. thermocellum為了進(jìn)一步提高嗜熱FAE酶在植物體內(nèi)的表達(dá)效率，我們?cè)趦?yōu)化基因的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了該嗜熱FAE酶在胞質(zhì)、質(zhì)外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體和線粒體中定位表達(dá)的重組基因植物表達(dá)載體。將優(yōu)化后人工合成的嗜熱FAE基因經(jīng)過NotI和NcoI雙酶切與ImpactVector載體的不同信號(hào)肽編碼序列融合，構(gòu)建了在植物不同亞細(xì)胞空間表達(dá)的ImpactVectors-FAE系列載體，以將嗜熱FAE蛋白靶向細(xì)胞質(zhì)，質(zhì)外體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，葉綠體和線粒體。再進(jìn)一步將構(gòu)建好的重組基因序列經(jīng)過PacI和AscI雙酶切插入到植物高效表達(dá)載體pBINPLUS中

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3571196