釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在燃料乙醇的生產(chǎn)中處于重要的地位,但釀酒酵母乙醇發(fā)酵背后的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍未被完全了解。本研究利用實(shí)驗(yàn)室建立的乙醇靜態(tài)發(fā)酵模型,檢測了釀酒酵母基因組中的150個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的單基因缺失株的乙醇產(chǎn)率。篩選出18個(gè)（占所有轉(zhuǎn)錄因子的10%左右）對釀酒酵母的乙醇發(fā)酵產(chǎn)率具有調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子主要參與細(xì)胞周期、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)合成。搖瓶發(fā)酵的結(jié)果顯示,與野生型菌株相比,MBP1,UME6,SWI4,SPT10和SWI6這5個(gè)基因的單基因缺失突變菌株在接種后32 h和52 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯示乙醇產(chǎn)率增加,而SRB8,NGG1,RTF1,RSC1和SWI3這5個(gè)基因的單基因缺失突變菌株僅在52 h顯示乙醇產(chǎn)率的顯著增加;相反,與野生型菌株相比,SEF1,INO2,INO4,RIC1,SPS18,YNR063W,HAC1和HAT1這8個(gè)基因的單基因缺失突變菌株在接種后32 h和52 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測得的乙醇產(chǎn)率均顯著降低。顯示乙醇產(chǎn)率增加的10個(gè)單基因缺失突變菌株中,只有RSC1的單... 

【文章來源】：山東理工大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

發(fā)酵32小時(shí)和52小時(shí)的乙醇產(chǎn)率

山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第四章釀酒酵母缺失突變株的乙醇耐受性26第四章釀酒酵母缺失突變株的乙醇耐受性4.1RSC1的缺失可提高酵母細(xì)胞對乙醇的耐受性乙醇產(chǎn)量增長的限制因素之一是釀酒酵母在發(fā)酵期間細(xì)胞的乙醇耐受水平。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測了發(fā)酵過程中顯示出乙醇產(chǎn)率增加的11個(gè)單基因缺失突變菌株的乙醇耐受性，結(jié)果如圖4.1所示。首先，對活化的單基因缺失株菌株進(jìn)行基因型檢測。由于實(shí)驗(yàn)所用的雙倍體單基因缺失株文庫的缺失基因是被抗G418的KanMX4遺傳標(biāo)記所替代，因此在各個(gè)缺失基因的上下游約200bp設(shè)計(jì)一對引物Gene-F/Gene-R，在KanMX4標(biāo)記序列內(nèi)部設(shè)計(jì)一對引物Kan-F/Kan-R。以各基因缺失株的基因組DNA為模板，分別用Gene-F/Kan-R和Kan-F/Gene-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證KanMX4敲除盒是否整合到相應(yīng)基因的位置上。然后，將基因型驗(yàn)證正確的基因缺失株及野生型菌株BG分別在在YPD和YPD加不同濃度的乙醇平板上進(jìn)行表現(xiàn)型檢測，觀察其生長情況。圖4.1乙醇耐受性的表型驗(yàn)證。分別在YPD和YPD加不同濃度的乙醇平板上測試野生型菌株BG、ace2/ace2、mbp1/mbp1、swi4/swi4、swi6/swi6、srb8/srb8、swi3/swi3、rsc1/rsc1、rtf1/rtf1,、spt10/spt10,、ngg1/ngg1和ume6/ume6基因突變株的表現(xiàn)型。平板在30℃培養(yǎng)2天。Fig.4.1Ethanoltoleranceassay.EthanoltolerantphenotypesofthewildtypeBG(WT),theace2/ace2,thembp1/mbp1,theswi4/swi4,theswi6/swi6,thesrb8/srb8,theswi3/swi3,thersc1/rsc1,thertf1/rtf1,thespt10/spt10,thengg1/ngg1andtheume6/ume6mutantsonYPDplatesandYPDplatescontainingindicatedconcentrationsofethanol.Plateswereincubatedat30oCfor2days.由圖4.1可知，與野生型菌株相比，ACE2的缺失突變菌株顯示出較高的乙醇耐受性，而RSC1的

山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第五章五升發(fā)酵罐的小試實(shí)驗(yàn)28第五章五升發(fā)酵罐的小試實(shí)驗(yàn)5.1發(fā)酵培養(yǎng)基的小試實(shí)驗(yàn)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)對乙醇生物合成負(fù)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。為進(jìn)一步探討這些轉(zhuǎn)錄因子基因的單基因缺失菌株在工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用中的潛在能力，本實(shí)驗(yàn)采用與搖瓶發(fā)酵一致的控制條件，通過容量為5升的小型發(fā)酵罐進(jìn)行了小試實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為3.5升，接種量為1%，發(fā)酵罐溫度設(shè)定為30℃。有氧發(fā)酵階段，發(fā)酵罐內(nèi)的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)定為220rpm，通氣量3L/min。8小時(shí)后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為150rpm，開始低轉(zhuǎn)速發(fā)酵。分別于接種后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，檢測發(fā)酵液中的葡萄糖和乙醇含量。結(jié)果如圖5.1和圖5.2所示。圖5.1發(fā)酵24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖濃度Fig.5.1Glucoseconcentrationatthreetimepointsoffermentationat24h,48hand72h由圖5.1可知，與對照野生型菌株相比，除INO2基因的缺失株在三個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)測得的葡萄糖含量與對照野生型菌株相似外，其余單基因缺失株測得的葡萄糖濃度均低于對照野生型菌株。其中，ACE2、SPT10和SWI4基因缺失株在三個(gè)取樣點(diǎn)的葡萄糖濃度均降低較多，說明這三個(gè)基因缺失株可有效提高葡萄糖的利用效率，具有提高乙醇產(chǎn)率的潛力。ACE2基因缺失株在24小時(shí)測得的葡萄糖濃度為76g/L，較對照野生型菌株降低了18.3%，在48小時(shí)測得的葡萄糖濃度為54g/L，較對照野生型菌株降低了37.2%，在72小時(shí)測得的葡萄糖濃度為36.3g/L，較對照野生型菌株降低了54%；SPT10基因缺失株在24小時(shí)測得的葡萄糖濃度為80.2g/L，較對照野生型菌株降低了13.8%，在48小時(shí)測得的葡萄糖濃度為55.2g/L，較對照野生型菌株降低了35.8%，在72小時(shí)測得的葡萄糖濃度為36.8g/L，較對照野生型菌株降低了53.4%；

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]生物傳感器法快速測定酒中的乙醇含量[J]. 馮東,王丙蓮,梁曉輝,李雪梅,李大海.  釀酒科技. 2012(02)
[2]生物傳感器的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 武寶利,張國梅,高春光,雙少敏.  中國生物工程雜志. 2004(07)



本文編號：3570020