隨著高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）的應(yīng)用,人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者的預(yù)期壽命得到了提升,同時(shí)發(fā)病率與死亡率明顯下降。而長期HIV感染引起的慢性炎癥與異常免疫激活及其造成的非艾滋病相關(guān)并發(fā)癥以及長期HAART累積的毒副作用更加引起了人們的注意。因此,本文為此開展了以下3部分研究。第一部分,為了探索與HIV感染引起的慢性免疫異常相關(guān)的基因,我們選取了65個(gè)免疫調(diào)節(jié)基因,在36例HIV感染者與健康對照的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）樣本中進(jìn)行檢測,篩選出了13例差異表達(dá)的基因。選取差異最明顯的3個(gè)基因:A20,S1PR1,USP18,繼續(xù)在48例具有不同HIV病毒載量的HAART治療者的PBMC中進(jìn)行檢查,并將結(jié)果與病毒載量以及CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)做相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。第二部分,為了研究A20在HIV感染中起到的作用,我們篩選出高表達(dá)A20的HIV靶細(xì)胞系:H9細(xì)胞,利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除H9細(xì)胞的A20基因。發(fā)現(xiàn)基因敲除后,細(xì)胞內(nèi)p-p65蛋白表達(dá)升高,核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor-kappa B）活化水平升高,同時(shí)細(xì)胞... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

免疫調(diào)節(jié)基因在HIV感染者、HAART治療者及正常健康對照之間的表達(dá)差異HIV感染未治療者（12例，病毒載量>10,000copies/ml）；HAART治療病毒學(xué)抑制成功者（12例，病毒載量低于檢測下限）；正常健康對照（12例）

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文正文第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果153.2差異表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)基因與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及病毒載量之間的關(guān)系這些基因參與固有免疫調(diào)節(jié)，因此可能與疾病進(jìn)展和HIV復(fù)制有關(guān)。如3.1所示A20、S1PR1和USP18是三個(gè)差異表達(dá)最多的基因。同時(shí)考慮到先前的12例未治療者均為高病毒載量水平（>10,000copies/ml），而12例HAART治療者的病毒載量均低于檢測值下限，因此我們另選了48例具有不同病毒載量水平的HAART治療者，檢測其PBMC中A20、S1PR1和USP18的表達(dá)水平，使用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)來評估這三個(gè)基因的表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)以及病毒載量之間的關(guān)系，如圖2所示。A20與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（P<0.05,R=0.31）；S1PR1與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（P<0.05,R=0.41）；USP18與病毒載量呈正相關(guān)(P<0.001，R=0.39)。圖1.248例HAART治療者PBMC免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平與病毒載量以及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性48例HAART治療者的病毒載量自低于檢測下限至80,000copies/ml不等。病毒載量低于檢測下限者將值設(shè)置為1copy/ml(log100)來更好的繪制圖形。用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)計(jì)算P值。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VL，病毒載量。

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文正文第二部分材料與方法24PCR管美國Axygen2.1.3細(xì)胞株與質(zhì)粒H9細(xì)胞、CEM-SS細(xì)胞、THP-1細(xì)胞、U937細(xì)胞、293T細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。質(zhì)粒lentiCRISPRv2，pMD2.G，psPAX2均購自Addgene；質(zhì)粒pNL(4-3)由中國科學(xué)院上海巴斯德研究所惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。lentiCRISPRv2質(zhì)粒圖譜如圖2.1所示。圖2.1lentiCRISPRv2質(zhì)粒圖譜2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1q-PCR與Westernblot篩選A20高表達(dá)細(xì)胞系2.2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)基本操作（1）細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存細(xì)胞，迅速放入37℃水浴中，輕柔搖晃，盡快解凍；用75%酒精消毒凍存管后，移至超凈臺(tái)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管，加入10倍體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，低速離心5分鐘（125xg，室溫），棄

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Non invasive evaluation of liver fibrosis in paediatric patients with nonalcoholic steatohepatitis[J]. Angelo Iacobellis,Matilde Marcellini,Angelo Andriulli,Francesco Perri,Gioacchino Leandro,Rita Devito,Valerio Nobili.  World Journal of Gastroenterology. 2006(48)



本文編號：3565830