發(fā)布時(shí)間：2022-01-01 01:30

　　白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）是一種引起對蝦爆發(fā)性死亡的病毒,因其傳播速度快、宿主范圍廣、致死率高等特點(diǎn),已成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重病害之一。目前全球已研制出多種藥物,如各種重組疫苗（DNA疫苗、RNA疫苗和蛋白亞單位疫苗）等,在實(shí)驗(yàn)室水平均有成效。然而,至今尚未見可在養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模應(yīng)用。我們研究集體已根據(jù)WSSV主要囊膜蛋白VP28在防治WSSV中的重要作用,用藍(lán)藻這一原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP28蛋白,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可有效免疫對蝦蝦苗�；谖覀冄芯考w十幾年來的研究進(jìn)展,本學(xué)位研究著重關(guān)注這種重組疫苗產(chǎn)業(yè)化過程中產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性,得到以下主要結(jié)果:（1）針對本疫苗在中試生產(chǎn)中發(fā)生目的基因丟失的情況,對重組載體質(zhì)粒（攜帶目的基因）的穩(wěn)定性作了分析。關(guān)鍵重組載體質(zhì)粒pRL-489-vp28和pGM-T-WSSV-vp28在轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后,通過不同抗生素壓力篩選得到保持良好穩(wěn)定性條件。發(fā)現(xiàn)前者超過10 h,后者超過7 h后,質(zhì)粒損失率均迅速大于10%。培養(yǎng)10-16個(gè)小時(shí)后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌液OD600值可達(dá)1.2-2.8之間,有效細(xì)菌平均卻只在6... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

WSSV(中國大陸株)基因組基本結(jié)構(gòu)

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文一個(gè)月，重組疫苗樣品便開始發(fā)黃、出現(xiàn)白色霉菌并有腥臭味(圖 3-1 C)；在 4 ℃低溫冰箱中存放的樣品雖然放置 5 個(gè)月時(shí)還沒有發(fā)出異味，但是會在四個(gè)月左右出現(xiàn)白色霉菌(圖 3-1 B)，且邊緣有藍(lán)色液體滲出(圖 3-1 D)，疑似為藻粉中藻藍(lán)蛋白從細(xì)胞里滲出。-80℃和-20℃條件下儲存的樣品變化差異不明顯，樣品表面仍為綠色的藻體本身顏色(圖 3-1 A)，但是否兩者之間有具體的變化、差異，需進(jìn)行更為細(xì)致的分子檢測和生物學(xué)活性檢測。

圖 3-3 RT-qPCR 檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3-3 RT-qPCR detection standard curve預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于重組疫苗本身的蛋白質(zhì)特性，樣品在 4℃處理?xiàng)l件下連月取樣中，超過2個(gè)月即無法提取完整RNA作為RT-qPCR檢測樣本模板得到其檢測結(jié)果。同理，30℃儲存的樣品在一個(gè)月以上時(shí)就開始發(fā)黃產(chǎn)生甚至變黏使其無法提取 RNA。因此在后續(xù)檢測中，連續(xù)三批重組疫苗取第 1-3 批樣品中，-80℃取樣均為儲存 6 個(gè)月的樣品（簡記為 A1、A2、A3），取樣均為儲存 6 個(gè)月的樣品（簡記為 B1、B2、B3），4℃取樣均為儲存 樣品（簡記為 C1、C2、C3），30℃取樣均為儲存 1 個(gè)月的樣品（簡記為D2、D3）。 3-5 是連續(xù)三批重組疫苗在不同儲存溫度下的 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖 3-電泳圖（引物大小 184bp）。綜合圖 3-4 和表 3-5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，樣品℃儲存 6 個(gè)月后仍具有良好的基因表達(dá)率，即 vp28 基因沒有丟失。-20℃、 30℃中儲存重組疫苗，即使儲存時(shí)間短，也有部分樣品中 vp28 基因丟失。The logarithm of the copy numberM A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[5]九種殺藻劑和三種復(fù)配殺藻劑對銅綠微囊藻、小球藻和水綿生長的影響[D]. 高偉.河南師范大學(xué) 2016
[6]對蝦WSSV和IHHNV病毒重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）快速檢測方法的研究[D]. 夏小明.上海海洋大學(xué) 2015
[7]廣西凡納濱對蝦白斑綜合征病毒的檢測及結(jié)構(gòu)蛋白VP24和VP51的克隆與表達(dá)[D]. 彭亞.廣西大學(xué) 2015
[8]肉食動物細(xì)小病毒重組疫苗研究[D]. 楊洋.吉林大學(xué) 2013
[9]中國大陸幾株WSSV毒株毒力測定及分析[D]. 劉飛.中國海洋大學(xué) 2013
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