CRISPR/Cas9是新一代基因組編輯技術(shù),可簡便快捷地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞對基因進(jìn)行敲除、敲入。但常規(guī)的CRISPR/Cas9表達(dá)系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)染效果差、病毒包裝效率低,極大地限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的廣泛使用。該研究應(yīng)用Tet-on系統(tǒng),建立了Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的293T細(xì)胞株,命名為293T-i Cas9。MEIS1（myeloid ectropic viral integration site 1）是TALE（three amino acid loop extension）同源域家族的轉(zhuǎn)錄因子,其在白血病發(fā)生發(fā)展、胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有重要作用,但其作用機(jī)制仍未完全明確。將靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293T-iCas9,SURVEYOR實(shí)驗(yàn)和Western blot檢測結(jié)果表明,sg MEIS1有效地指導(dǎo)Cas9進(jìn)行基因組編輯。最終經(jīng)測序和Western blot結(jié)果證明,成功建立了MEIS1敲除細(xì)胞株,這為研究MEIS1的功能提供了重要的工具。 

【文章來源】：中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2016,38(08)CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒
        1.1.2 試劑及儀器
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 sg RNA設(shè)計(jì)與sg RNA表達(dá)載體構(gòu)建
        1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.2.3 病毒包裝、感染及轉(zhuǎn)染
        1.2.4 基因組DNA提取
        1.2.5 SURVEYOR檢測突變效率
        1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)
        1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)
        1.2.7 測序及序列分析
        1.2.8 脫靶效應(yīng)驗(yàn)證
2 結(jié)果
    2.1 構(gòu)建Dox誘導(dǎo)表達(dá)Cas9的慢病毒載體
    2.2 建立Dox誘導(dǎo)表達(dá)Cas9的293T-i Cas9細(xì)胞株
    2.3 鑒定sg MEIS1表達(dá)載體對MEIS1基因組編輯的功能
    2.4 利用Dox誘導(dǎo)表達(dá)Cas9的方法建立MEIS1基因敲除的293T細(xì)胞株
3 討論



本文編號：3551558