種子特異性啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因只在植物種子中大量表達(dá),外源基因組織特異性轉(zhuǎn)錄活性的高低通常由啟動(dòng)子上的順式作用元件來(lái)參與調(diào)控。研究表明,ABRE元件是與種子特異性表達(dá)相關(guān)的元件,因此,對(duì)該元件進(jìn)行功能初析,能夠?yàn)楹罄m(xù)更加深入的研究種子特異性啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。擬南芥At3g21380基因是一種甘露糖結(jié)合蛋白編碼基因,實(shí)驗(yàn)室之前研究結(jié)果證明該基因啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。此外,對(duì)該基因啟動(dòng)子上的順式作用元件分析結(jié)果還表明:在啟動(dòng)子中存在ABRE元件和RY元件、skn-1元件、GCN4元件等與種子特異性表達(dá)相關(guān)的順式作用元件。在本項(xiàng)研究中,為了明確ABRE元件對(duì)At3g21380啟動(dòng)子種子特異性轉(zhuǎn)錄活性的影響,首先通過(guò)設(shè)計(jì)ABRE元件的突變位點(diǎn)及特異性PCR擴(kuò)增引物,克隆得到突變啟動(dòng)子片段,然后將目的片段連接到植物基因表達(dá)載體上。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將驗(yàn)證正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。收獲浸染后的擬南芥種子進(jìn)行潮霉素抗性篩選實(shí)驗(yàn)。將篩選之后得到的轉(zhuǎn)基因純系擬南芥進(jìn)行PCR鑒定,最終獲得含有正確突變啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)基因純系擬南芥。對(duì)野生型及突變啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)基因純系種子進(jìn)行GUS染... 

【文章來(lái)源】：曲阜師范大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：41 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

第三章結(jié)果與分析19第三章結(jié)果與分析3.1ABRE元件突變啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增鑒定實(shí)驗(yàn)室前期的分析結(jié)果表明：在At3g21380啟動(dòng)子上含有兩個(gè)ABRE元件。參考該分析結(jié)果，將這兩個(gè)ABRE元件分別命名為ABRE1和ABRE2，以野生型啟動(dòng)子At3g21380的重組質(zhì)粒為模板，根據(jù)ABRE1序列和ABRE2序列，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)突變引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)果顯示，各突變產(chǎn)物片段電泳條帶位置符合預(yù)期擴(kuò)增目的序列的910bp大小(圖3.1)。圖3.1突變啟動(dòng)子片段PCR產(chǎn)物M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：ABRE1突變啟動(dòng)子片段；2：ABRE2突變啟動(dòng)子片段Figure3.1PCRproductofthemutantpromoterfragmentsM:DNAMaker;1:theABRE1mutantpromoterfragment;2:theABRE2mutantpromoterfragment3.2ABRE元件突變啟動(dòng)子表達(dá)載體的酶切鑒定提取陽(yáng)性菌落的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行雙酶切，酶切后電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示，酶切后均產(chǎn)生一大、一小兩條條帶。其中，大條帶位置與預(yù)期線性載體片段長(zhǎng)度吻合，小條帶位置符合預(yù)期擴(kuò)增目的序列的910bp大小(圖3.2)。將經(jīng)過(guò)酶切鑒定正確的陽(yáng)性菌落送往公司測(cè)序。最終測(cè)序結(jié)果表明突變片段序列與預(yù)期序列一致，pMUTABRE1-GUS和pMUTABRE2-GUS均構(gòu)建成功。

第三章結(jié)果與分析20圖3.2表達(dá)載體的雙酶切鑒定M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：pMUTABRE1-GUS載體雙酶切片段；2：pMUTABRE2-GUS載體雙酶切片段Figure3.2doubledigestionofexpressionvectorM:DNAMarker;1:pMUTABRE1-GUSvectordoubledigestionfragment;2:pMUTABRE2-GUSvectordoubledigestionfragment3.3ABRE元件突變啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因純合株系的篩選與獲得為獲得純合突變體株系，首先將已經(jīng)得到的pMUTABRE1-GUS和pMUTABRE2-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，再經(jīng)農(nóng)桿菌浸染野生型擬南芥，之后收獲T0代種子。按照上述篩選純合株系的方法，通過(guò)含潮霉素抗性的1/2MS固體培養(yǎng)基，對(duì)T0代種子進(jìn)行抗性篩選實(shí)驗(yàn)，獲得T1代種子，繼續(xù)按照同樣的篩選方法，又獲得T2代種子，最終通過(guò)抗性篩選實(shí)驗(yàn)，成功獲得了含有pMUTABRE1-GUS和pMUTABRE2-GUS表達(dá)載體的T3代突變體純合株系。通過(guò)PCR擴(kuò)增方法對(duì)MUTABRE1-GUS和MUTABRE2-GUS轉(zhuǎn)基因純合株系進(jìn)行陽(yáng)性篩選鑒定。以下是部分株系的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3.3)。電泳結(jié)果顯示，電泳條帶位置符合預(yù)期擴(kuò)增目的序列的540bp大小，說(shuō)明兩個(gè)ABRE元件突變啟動(dòng)子均成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入擬南芥，實(shí)驗(yàn)最終獲得了正確含有ABRE元件突變啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因純合株系。圖3.3突變啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因純合株系PCR鑒定M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-4：pMUTABRE1-GUS轉(zhuǎn)基因純合株系；5-8：pMUTABRE2-GUS轉(zhuǎn)基


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