視覺作為人類最重要的感知覺,承擔(dān)人類80%以上的外界信息獲取。視網(wǎng)膜則是視覺功能的起始器官,其位于眼球底部,含有多種嚴(yán)格分層的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。視網(wǎng)膜中的感光細(xì)胞負(fù)責(zé)把光信號轉(zhuǎn)化為電信號,通過多級神經(jīng)元,將信號最終傳輸給大腦中樞。但是,遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病由于基因突變或者缺失,導(dǎo)致感光細(xì)胞不可逆死亡,剝奪了患者看見光明的機(jī)會。視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis Pigmentosa,RP)便是其中的一大亞類,其致病基因廣,基因突變高度異質(zhì)化,目前治療手段發(fā)展仍十分緩慢。視網(wǎng)膜色素變性是一種較為常見的遺傳性視網(wǎng)膜疾病。研究發(fā)現(xiàn)患者發(fā)病初期由于視桿細(xì)胞死亡而出現(xiàn)夜盲癥,后期伴隨著視錐細(xì)胞的逐漸喪失,白天視力下降,最終完全致盲。目前有超過50個基因被鑒定與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)。為了研究視網(wǎng)膜色素變性的潛在致病機(jī)制并開發(fā)相應(yīng)的治療方法,研究者已經(jīng)建立了多個視網(wǎng)膜色素變性嚙齒類動物模型,如rd1,rd10,Rho-/-和RhoP23H/+突變小鼠等。這些模型表現(xiàn)出感光細(xì)胞和視力的逐漸喪失,部分模擬了人類視網(wǎng)膜色素變性病理特征。然而,嚙齒類動物與人類在進(jìn)化上相距較遠(yuǎn),在遺傳學(xué)水平上和生理學(xué)水平上存...

【文章來源】： 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

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摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及功能
        1.1.1 視網(wǎng)膜的組成
        1.1.2 光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
    1.2 視網(wǎng)膜色素變性
        1.2.1 視網(wǎng)膜色素變性的臨床特征
        1.2.2 視網(wǎng)膜色素變性的致病基因及遺傳
        1.2.3 RHO基因的致病機(jī)理
    1.3 常用的視網(wǎng)膜色素變性動物模型
        1.3.1 嚙齒類動物視網(wǎng)膜色素變性模型
        1.3.2 大動物視網(wǎng)膜色素變性模型
    1.4 CRISPR/Cas9基因編輯工具
    1.5 AAV基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體
    1.6 本課題的選題理由及主要研究內(nèi)容
        1.6.1 課題背景及選題目的
        1.6.2 課題研究內(nèi)容
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物倫理許可
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物管理
    2.2 常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)
        2.2.1 PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        2.2.2 DNA凝膠回收
        2.2.3 限制性內(nèi)切酶酶切與DNA連接
        2.2.4 T-A克隆
        2.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
        2.2.6 鑒定目標(biāo)克隆
        2.2.7 質(zhì)粒的小量抽提
        2.2.8 質(zhì)粒的大量抽提
        2.2.9 Q-PCR實(shí)驗(yàn)
    2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        2.3.1 HEK293T細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
        2.3.2 HEK293T細(xì)胞的傳代
        2.3.3 HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
    2.4 AAV載體構(gòu)建和病毒制備
        2.4.1 CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建
        2.4.2 熒光報告基因表達(dá)載體構(gòu)建
        2.4.3 AAV病毒的包裝
        2.4.4 AAV病毒的純化
        2.4.5 AAV病毒滴度的測定
        2.4.6 AAV病毒感染力檢測
        2.4.7 透射電子顯微鏡(TEM)檢測AAV
    2.5 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的提取與檢測
        2.5.1 基因組DNA的提取
        2.5.2 SaCas9敲除效率檢測
        2.5.3 TRlzol提取RNA
        2.5.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)
        2.5.5 蛋白質(zhì)的提取
        2.5.6 Western blot
        2.5.7 De novo Sequence
    2.6 冷凍切片、免疫組化和顯微成像
        2.6.1 視網(wǎng)膜冷凍切片
        2.6.2 免疫組化染色
    2.7 視網(wǎng)膜下腔注射
        2.7.1 獼猴視網(wǎng)膜下腔注射
        2.7.2 小鼠視網(wǎng)膜下腔注射
    2.8 獼猴視網(wǎng)膜臨床檢查
        2.8.1 眼底成像與熒光造影成像
        2.8.2 OCT成像
    2.9 透射電子顯微鏡(TEM)成像
    2.10 離體視網(wǎng)膜電圖(ex vivo ERG)記錄
        2.10.1 離體ERG
        2.10.2 ERG a-wave的分離
    2.11 統(tǒng)計分析
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論
    3.1 CRISPR/SaCas9敲除獼猴RHO的分子設(shè)計
    3.2 AAV-CRISPR/SaCas9系統(tǒng)有效性檢驗(yàn)
        3.2.1 hSyn啟動子在HEK293T和感光細(xì)胞中有效表達(dá)檢驗(yàn)
        3.2.2 視網(wǎng)膜下腔注射ShH10 AAV血清型特異感染感光細(xì)胞
        3.2.3 體外檢驗(yàn)CRISPR/SaCas9系統(tǒng)有效性
    3.3 在體AAV-CRISPR/SaCas9系統(tǒng)有效敲除獼猴感光細(xì)胞RHO
        3.3.1 在體敲除獼猴視網(wǎng)膜RHO實(shí)驗(yàn)設(shè)計
        3.3.2 獼猴感光細(xì)胞RHO被有效敲除
        3.3.3 Cas9-RHO視網(wǎng)膜RHO蛋白表達(dá)顯著降低
    3.4 敲除RHO的獼猴視網(wǎng)膜產(chǎn)生類似RP的感光細(xì)胞退化
        3.4.1 Cas9-RHO視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞發(fā)生退化
        3.4.2 Cas9-RHO視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞發(fā)生退化
        3.4.3 Cas9-RHO視網(wǎng)膜進(jìn)行性退化
        3.4.4 Cas9-RHO視網(wǎng)膜發(fā)生膠質(zhì)細(xì)胞活化
    3.5 Cas9-RHO視網(wǎng)膜顯示出與RP一致的臨床特征
        3.5.1 Cas9-RHO視網(wǎng)膜存在血管病變
        3.5.2 Cas9-RHO視網(wǎng)膜表現(xiàn)明顯的外核層變薄
        3.5.3 OCT顯示Cas9-RHO視網(wǎng)膜進(jìn)行性退化
    3.6 Cas9-RHO視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)退化
    3.7 Cas9-RHO視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜生理功能受損
        3.7.1 ex vivo ERG記錄與a-wave的分離
        3.7.2 Cas9-RHO視網(wǎng)膜感光細(xì)胞光反應(yīng)降低
第4章 總結(jié)與討論
    4.1 工作總結(jié)
    4.2 工作創(chuàng)新性及其應(yīng)用
        4.2.1 本研究意義和創(chuàng)新性
        4.2.2 本研究應(yīng)用
    4.3 工作局限及未來方向
        4.3.1 基于生殖細(xì)胞基因編輯的非人靈長類RP模型仍是必要的
        4.3.2 更高效的在體基因編輯效率
        4.3.3 機(jī)械損傷與病理發(fā)生相分離
        4.3.4 在體基因編輯效率的確定
        4.3.5 在體基因編輯的拓展
參考文獻(xiàn)
附錄A 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
附錄B 主要試劑
附錄C 主要溶液配制
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的研究成果



本文編號：3544745