茶樹谷氨酰胺合成酶（CsGS1-3）基因工程菌的構(gòu)建
發(fā)布時(shí)間：2021-12-17 03:59
谷氨酰胺（Glutamine,Gln）,學(xué)名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸,是植物體內(nèi)氮運(yùn)輸?shù)闹饕问?參與植物體內(nèi)氨的再同化等代謝作用,在植物的生長發(fā)育過程中起重要的作用。谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase,GS）是植物中（GS/GOGAT）氨同化的主要途徑,其中GS催化NH4+同化成谷氨酰胺。由于GS是氮代謝的關(guān)鍵酶,并且有研究表明利用GS可以催化谷氨酰胺和乙胺發(fā)生轉(zhuǎn)谷氨�；磻�(yīng)從而得到茶氨酸,因此本研究以此為啟發(fā)點(diǎn),研究鑒定了茶樹GS基因的功能并進(jìn)行了 GS工程菌的構(gòu)建。本文從茶樹根部cDNA中成功克隆CsGS1-3（登錄號:AB117934.1）,并將其與穿梭表達(dá)載體pZ8-1連接,通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入谷氨酸棒狀桿菌中對CsGS酶活力進(jìn)行驗(yàn)證,隨后將其與表達(dá)載體pET-32a（+）、pGEX-4T-1連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行酶活力驗(yàn)證并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。主要研究結(jié)果如下:（1）從茶樹根部cDNA中成功克隆CsGS1-3,該基因ORF長度為1071bp,由357個(gè)氨基酸組成,分子量為39.21 kD,理論等電點(diǎn)為5.47,利用全序列氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,...
【文章來源】： 江麗娜 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【文章頁數(shù)】：70 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖２－１技術(shù)路線??Ｆｉｇ．２－１?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ??
提取的總ＲＮＡ經(jīng)１．２?％瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有兩條清晰的??２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ，條帶沒有拖尾情況，同時(shí)用核酸測量儀檢測ＲＮＡ的濃度，以??及ＯＤ２６〇／ＯＤ２８〇和ＯＤ２６〇／〇Ｄ２３〇的比值情況。結(jié)果顯示總ＲＮＡＯＤ２６ｇ／ＯＤ２８ｇ比值在１．８－??２．２，ＯＤ２６〇／ＯＤ２３〇比值在１．８－２．２之間，說明提取的ＲＮＡ的質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)??實(shí)驗(yàn)。??４．１．２?ＣｓＧＳ／ｄ的克隆及序列分析??以茶樹根部ｃＤＮＡ為模板，通過ＰＣＲ擴(kuò)增得到１０７１ｂｐ的片段（圖４－丨），此序列??與ＮＣＢＩ上ＣｓＧＳ／－Ｊ（ＡＢ１１７９３４．１）的序列一致。通過生物信息學(xué)分析，ＣｓＧＳ／－３的??開放閱讀框（ＯＲＦ）為１０７１ｂｐ，共編碼３５７個(gè)氨基酸，蛋白分子量為３９．２１ｋＤ，理論??等電點(diǎn)為５．４７。通過ＣｓＧＳｌ－３氨基酸序列與其他植物中的谷氨酰胺合成酶氨基酸序??列進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)ＣｓＧＳｌ－３氨基酸序列與獼猴桃（ＰＳＲ９６５９丨．１）的親緣關(guān)系最近（圖４－??２）。運(yùn)用ＭｅｇＡｌｉｇｎ軟件將測序結(jié)果與ＮＣＢＩ上ＣＸ？幻－Ｊ原氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)??現(xiàn)結(jié)果一致無錯(cuò)配。??Ｍ?１?２?３?４??ｂｐ??１０（Ｈ）?ｈｐ?）??ｂｐ??５００?ｈｐ??ｂｐ??１００?ｂｐ??圖４－１?ＯＲＦ擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖??Ｍ．２ＫｂＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)；１￣４．目的基因Ｃ＾Ｓ／－３??Ｆｉｇ，?４－１?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ＣｓＧＳｌ－３??Ｍ．?２?Ｋｂ?ｍａｋｅｒ?ｏｆ?ＤＮＡ；?１?－４．?ｐ
粒提取，通過電轉(zhuǎn)進(jìn)入谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單菌落（如圖４－６）??測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌重組菌株??１３０２２／ｐＺ８－ＱＧ５７－３〇??＼１?１?２?３??２０００?ｂｐ??ｌＯＯＯｂｐ??７５０?ｂｐ??５００?ｈｐ??２§０ｂｐ??ｌＯＯｈｐ??圖４－３?ＣｊＧ＊Ｓ廠３?ＯＲＦ擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖??Ｍ．２ＫｂＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)；１－３．?dāng)U增產(chǎn)物０仍／－３??Ｆｉｇ．?４－３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ＯＲＦ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＣｓＧＳｌ－３??Ｍ．?２?Ｋｂ?ＤＮＡ?ｍａｋｅｒ；?１－３．?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＣｓＧＳｌ－３??２５??
本文編號：3539365
【文章來源】： 江麗娜 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【文章頁數(shù)】：70 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖２－１技術(shù)路線??Ｆｉｇ．２－１?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ??
提取的總ＲＮＡ經(jīng)１．２?％瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有兩條清晰的??２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ，條帶沒有拖尾情況，同時(shí)用核酸測量儀檢測ＲＮＡ的濃度，以??及ＯＤ２６〇／ＯＤ２８〇和ＯＤ２６〇／〇Ｄ２３〇的比值情況。結(jié)果顯示總ＲＮＡＯＤ２６ｇ／ＯＤ２８ｇ比值在１．８－??２．２，ＯＤ２６〇／ＯＤ２３〇比值在１．８－２．２之間，說明提取的ＲＮＡ的質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)??實(shí)驗(yàn)。??４．１．２?ＣｓＧＳ／ｄ的克隆及序列分析??以茶樹根部ｃＤＮＡ為模板，通過ＰＣＲ擴(kuò)增得到１０７１ｂｐ的片段（圖４－丨），此序列??與ＮＣＢＩ上ＣｓＧＳ／－Ｊ（ＡＢ１１７９３４．１）的序列一致。通過生物信息學(xué)分析，ＣｓＧＳ／－３的??開放閱讀框（ＯＲＦ）為１０７１ｂｐ，共編碼３５７個(gè)氨基酸，蛋白分子量為３９．２１ｋＤ，理論??等電點(diǎn)為５．４７。通過ＣｓＧＳｌ－３氨基酸序列與其他植物中的谷氨酰胺合成酶氨基酸序??列進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)ＣｓＧＳｌ－３氨基酸序列與獼猴桃（ＰＳＲ９６５９丨．１）的親緣關(guān)系最近（圖４－??２）。運(yùn)用ＭｅｇＡｌｉｇｎ軟件將測序結(jié)果與ＮＣＢＩ上ＣＸ？幻－Ｊ原氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)??現(xiàn)結(jié)果一致無錯(cuò)配。??Ｍ?１?２?３?４??ｂｐ??１０（Ｈ）?ｈｐ?）??ｂｐ??５００?ｈｐ??ｂｐ??１００?ｂｐ??圖４－１?ＯＲＦ擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖??Ｍ．２ＫｂＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)；１￣４．目的基因Ｃ＾Ｓ／－３??Ｆｉｇ，?４－１?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ＣｓＧＳｌ－３??Ｍ．?２?Ｋｂ?ｍａｋｅｒ?ｏｆ?ＤＮＡ；?１?－４．?ｐ
粒提取，通過電轉(zhuǎn)進(jìn)入谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單菌落（如圖４－６）??測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌重組菌株??１３０２２／ｐＺ８－ＱＧ５７－３〇??＼１?１?２?３??２０００?ｂｐ??ｌＯＯＯｂｐ??７５０?ｂｐ??５００?ｈｐ??２§０ｂｐ??ｌＯＯｈｐ??圖４－３?ＣｊＧ＊Ｓ廠３?ＯＲＦ擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖??Ｍ．２ＫｂＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)；１－３．?dāng)U增產(chǎn)物０仍／－３??Ｆｉｇ．?４－３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ＯＲＦ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＣｓＧＳｌ－３??Ｍ．?２?Ｋｂ?ＤＮＡ?ｍａｋｅｒ；?１－３．?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＣｓＧＳｌ－３??２５??
本文編號：3539365
本文鏈接：http://sikaile.net/kejilunwen/jiyingongcheng/3539365.html
最近更新
教材專著
