家族寒冷性蕁麻疹中有一種家族患病與人類16號染色體上磷脂酶Cγ2（phospholipase C gamma 2,Plcg2）基因缺失20至22號外顯子密切相關(guān),這種缺失引發(fā)了多個(gè)白細(xì)胞亞群中信號傳導(dǎo)異常,導(dǎo)致了機(jī)體免疫紊亂表型的出現(xiàn)。為了進(jìn)一步探究Plcg2介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞亞群的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的具體機(jī)制,本課題對已構(gòu)建的Plcg2基因缺失20-22號外顯子模型小鼠的相關(guān)免疫細(xì)胞百分比及鈣離子通量變化情況進(jìn)行檢測分析,確定該模型小鼠對下一步機(jī)制研究的可靠性。同時(shí),Plcg2基因的研究中發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞RNA測序發(fā)現(xiàn)FosB基因在生發(fā)中心B細(xì)胞相比于初始B細(xì)胞存在著高表達(dá)現(xiàn)象,為了進(jìn)一步探究該基因?qū)ν庵芰馨图?xì)胞的具體功能和作用機(jī)制,課題計(jì)劃構(gòu)建FosB基因敲除小鼠模型從而為深入探究相關(guān)功能和機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)對象。新一代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是一種簡便快捷的基因編輯工具,它的開發(fā)應(yīng)用極大地方便了生物科學(xué)研究。本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)平臺,使用sgRNA和Cas9蛋白對小鼠胚胎進(jìn)行顯微注射來獲得FosB基因敲除小鼠模型。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對Plcg2（exon20-22）小鼠檢測... 

【文章來源】：福建師范大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

FosB基因敲除策略

福建師范大學(xué)李奎碩士學(xué)位論文-28-圖1-1FosB基因敲除策略Fig1-1FosBgeneknockoutstrategy3.2敲除載體的鑒定將目的基因FosB的四個(gè)不同sgRNA與酶切后的PX459連接得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化涂板過夜培養(yǎng)后挑取白色單克隆菌落，用sgRNA轉(zhuǎn)錄模板的引物對該菌落先進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對能擴(kuò)增出目的條帶的單克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，然后送去測序公司測序。經(jīng)由Bioedit軟件對測序結(jié)果與sgRNA序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示四個(gè)sgRNA分別與PX459載體連接成功，說明四個(gè)敲除載體已成功構(gòu)建。圖1-2PX459-FosB-sRNA敲除質(zhì)粒鑒定Fig1-2TheIdentificationoftheknockoutplasmidPX459-FosB-sgRNA

第一章應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)建立FosB基因敲除小鼠模型-29-3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)中，我們將L929細(xì)胞接種于六孔板中，設(shè)置重復(fù)的實(shí)驗(yàn)組和對照組，對照組中除了空白對照以外，還有用于觀察轉(zhuǎn)染效率的GFP質(zhì)粒對照組。L929細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后即可在倒置熒光相差顯微鏡下面通過GFP的表達(dá)情況來觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)過流式分析后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率約為30%。圖1-3通過GFP表達(dá)觀察L929細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（10X）Fig1-3.ObservationoftransfectionefficiencyofL929cellsbyGFPexpressionGFP：在激發(fā)光下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況熒光蛋白表達(dá)；BF：明場中同一視野下的細(xì)胞生長情況，比例尺為100um3.4對轉(zhuǎn)染敲除質(zhì)粒的L929細(xì)胞PCR鑒定和T7E1酶切結(jié)果轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過藥物篩選后重新長滿六孔板時(shí)，取出實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞提取基因組DNA，經(jīng)PCR及測序驗(yàn)證和T7E1體外酶切驗(yàn)證；結(jié)果顯示在設(shè)計(jì)的四個(gè)sgRNA敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組中，僅在sg4實(shí)驗(yàn)組的測序結(jié)果中出現(xiàn)了套峰的現(xiàn)象（圖1-3）；且僅有sg4實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組目的片段經(jīng)T7E1體外酶切后出現(xiàn)兩條被切割后條帶，且條帶大小分別約為443bp與300bp（圖1-4）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)測序以及T7E1


本文編號：3519526