水稻是世界上最重要的糧食作物之一,而鱗翅目昆蟲如螟蟲等是水稻生產(chǎn)中的主要蟲害,常規(guī)的農(nóng)藥防治螟蟲不但增加成本投入,而且還容易誘使昆蟲產(chǎn)生抗藥性�；趩我豢瓜x基因容易使昆蟲產(chǎn)生抗性以及公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻食用安全性過(guò)度擔(dān)憂的現(xiàn)狀,本文從以下兩方面開展了研究:聚合兩個(gè)不同的抗蟲基因以培育持久抗蟲水稻新材料;對(duì)已有轉(zhuǎn)化體進(jìn)行鑒定和分析以盡快獲得我們期望的胚乳零表達(dá)型抗蟲水稻新材料,并取得了如下研究結(jié)果:一、綠色組織特異表達(dá)性抗蟲水稻新材料的檢測(cè)與驗(yàn)證利用PCR技術(shù)從12個(gè)不同的轉(zhuǎn)化體中獲得8個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)Southern雜交,篩選到5個(gè)單拷貝的材料。對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)化系中的Cry1Ab/1Ac蛋白進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示:在分蘗期和灌漿期葉片和莖稈中,5個(gè)轉(zhuǎn)化系均能檢測(cè)到抗蟲蛋白,葉片中的表達(dá)量顯著高于莖稈。五個(gè)轉(zhuǎn)化系的Cry1Ab/1Ac蛋白含量在整體水平上比陽(yáng)性對(duì)照浙優(yōu)3號(hào)高,部分轉(zhuǎn)化系葉片中的表達(dá)量比對(duì)照甚至高出10倍左右。在胚乳中,在各轉(zhuǎn)化系內(nèi)檢測(cè)值與陰性對(duì)照之間沒有顯著差異,顯著低于浙優(yōu)3號(hào)的0.23μg/g。此外,田間對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗蟲鑒定,結(jié)果顯示野生型對(duì)照在人工接蟲二化螟后單... 

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圖２．１表迗載體ｐＳＢ１３０－ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ載體構(gòu)建圖

ＲＢ?ＬＢ??圖２．１表迗載體ｐＳＢ１３０－ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ載體構(gòu)建圖。??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＳＢ１３０－ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ．??２．４．２目標(biāo)基因鑒定及雜交分析??Ｔ２代從８?jìng)�(gè)轉(zhuǎn)化體分離出４８?jìng)�(gè)左右不同轉(zhuǎn)化系，分別從毎個(gè)轉(zhuǎn)化系內(nèi)隨機(jī)??選�。保矀�(gè)單株，在分蘗期取樣抽提基因組ＤＮＡ利用ＰＣＲ鑒定Ｃ／７Ｌ４６／以ｃ基因。??選擇轉(zhuǎn)化系內(nèi)所有１２個(gè)單株都攜帶基因的轉(zhuǎn)化系，認(rèn)定為純系。共??從８?jìng)�(gè)不同的轉(zhuǎn)化體里各分離到１個(gè)純系，即８?jìng)�(gè)純合的轉(zhuǎn)化系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分??析。８?個(gè)轉(zhuǎn)化系分別命名為?ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－１、ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－２、ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－３、ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－７、??ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－８、ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－１０、ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－１?１、ｒｂｃＳ－ｔｐ－Ｂｔ－１２。??在分蘗盛期，分別提取上述８?jìng)�(gè)純合的轉(zhuǎn)化系及對(duì)照品種的高質(zhì)量基因組??ＤＮＡ進(jìn)行５ｂｗ／／７ｅＡ７７雜交分析，結(jié)果如圖２．２所示。結(jié)果顯示不同的轉(zhuǎn)化系植株??中插入的基因拷貝數(shù)在１－４個(gè)之間，其中單拷貝材料有５個(gè)。單拷??貝的材料具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、便于分離基因插入位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)

是浙優(yōu)３號(hào)的２－１０倍和２－１１倍。而在同一轉(zhuǎn)化系內(nèi)，分蘗期和灌漿期ＣｒｙｌＡｂ／ｌＡｃ??蛋白的表達(dá)量差異不大，說(shuō)明ＣｒｙｌＡｂ／ｌＡｃ蛋白在整個(gè)生育期內(nèi)都能相對(duì)穩(wěn)定表??迗（圖２．３）。??２０??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]一種Bt基因融合策略在治理害蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和水稻抗性中的應(yīng)用[D]. 許超.浙江大學(xué) 2018
[2]水稻組織特異表達(dá)啟動(dòng)子的分離克隆、功能分析及應(yīng)用[D]. 葉榮建.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[3]雙價(jià)Bt抗蟲水稻的培育和轉(zhuǎn)基因水稻回交效應(yīng)分析[D]. 楊宙.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]蘇云金桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白vip3基因及其在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用[D]. 方軍.浙江大學(xué) 2008

碩士論文
[1]雙價(jià)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的育成和鑒定[D]. 李聰.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3509178