CRISPR/Cas9介導基因編輯制備FoxJ1缺失小鼠氣道上皮細胞和遺傳修飾雪貂模型
發(fā)布時間：2021-11-06 11:11
基因編輯是指借助細胞自身的基因組損傷修復機制對目標基因的核苷酸序列進行堿基刪除、插入、定點突變和組合編輯等基因操作技術。近年出現(xiàn)的CRISPR/Cas9定點基因編輯技術極大提高了基因編輯效率、推進了基因功能的研究,并在構建人類疾病模型、推動基因治療、加快農(nóng)作物和動物的遺傳改良等領域有著巨大的應用潛力。在傳統(tǒng)的呼吸道干細胞功能研究中,需要使用基因型相同的細胞群作為研究對象。如何運用CRISPR技術對呼吸道干細胞群進行基因編輯,并高效的篩選陽性編輯的細胞成為了一個急需攻克的難題。本研究首次將熒光報告基因的優(yōu)勢與CRISPR/Cas9介導的基因敲除技術的特點相結合,建立了有效的基因編輯細胞富集平臺,突破了 CRISPR技術在干細胞研究領域的應用瓶頸。首先,采用經(jīng)體外酶切篩選出高效靶向Loxp位點的sgRNA（LoxP-sgRNA）轉(zhuǎn)染表達Cas9的ROSA26-LoxP-tdTomato-stop-LoxP-EGFP（ROSA-TG）報告基因小鼠氣道上皮細胞,結果發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9高效介導LoxP位點中間的tdTomato基因剪切,紅色熒光細胞向綠色和無色熒光的轉(zhuǎn)變率達到72.7%。...
【文章來源】：寧夏大學寧夏回族自治區(qū) 211工程院校
【文章頁數(shù)】：107 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
正常成年小鼠體內(nèi)穩(wěn)態(tài)時肺上皮的組成lavtFig.l}lThecompositionoftheadultmouselungepitheliumduringnormalhomeostasists1
的兩個同樣序列的Ｌｏｘｐ位點．將使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，導致原來表達紅色膜蛋白??的紅色細胞將因為的切除改為表達￡ＧＦＰ綠色膜蛋白而逐漸變成綠色。由此，該??模型以細胞表面明顯的紅綠熒光轉(zhuǎn)變，報告其內(nèi)部基因被編輯的事件．如圖２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??圖２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位點設計示意圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ轉(zhuǎn)基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ設計??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ質(zhì)粒設計并驗證靶向敲除如〇的引導ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列與兩段重復的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在設計敲??除的ｓｇＲＮＡ時．采用了兩種不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ設計在膜定位序列，Ｃａｓ９單酶切靶??向位點形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因為移碼突變而無法表達。２）?ｓｇＲＮＡ設汁在??重復的序列，Ｃａｓ９將在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ內(nèi)識別兩個耙向位點形成雙酶切，使兩個耙位點內(nèi)堿基??敲除，兩個靶位點同時發(fā)生片段插入或缺失使得其后的序列因為移碼突變而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位點設Ｕ？草圖如圖２－２所示，根據(jù)ｓｇＲＮＡ設計原則以及單酶切和雙??酶切兩種策略．分別設計１條單酶切和２條雙酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
的兩個同樣序列的Ｌｏｘｐ位點．將使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，導致原來表達紅色膜蛋白??的紅色細胞將因為的切除改為表達￡ＧＦＰ綠色膜蛋白而逐漸變成綠色。由此，該??模型以細胞表面明顯的紅綠熒光轉(zhuǎn)變，報告其內(nèi)部基因被編輯的事件．如圖２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??圖２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位點設計示意圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ轉(zhuǎn)基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ設計??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ質(zhì)粒設計并驗證靶向敲除如〇的引導ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列與兩段重復的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在設計敲??除的ｓｇＲＮＡ時．采用了兩種不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ設計在膜定位序列，Ｃａｓ９單酶切靶??向位點形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因為移碼突變而無法表達。２）?ｓｇＲＮＡ設汁在??重復的序列，Ｃａｓ９將在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ內(nèi)識別兩個耙向位點形成雙酶切，使兩個耙位點內(nèi)堿基??敲除，兩個靶位點同時發(fā)生片段插入或缺失使得其后的序列因為移碼突變而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位點設Ｕ？草圖如圖２－２所示，根據(jù)ｓｇＲＮＡ設計原則以及單酶切和雙??酶切兩種策略．分別設計１條單酶切和２條雙酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
本文編號：3479728
【文章來源】：寧夏大學寧夏回族自治區(qū) 211工程院校
【文章頁數(shù)】：107 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
正常成年小鼠體內(nèi)穩(wěn)態(tài)時肺上皮的組成lavtFig.l}lThecompositionoftheadultmouselungepitheliumduringnormalhomeostasists1
的兩個同樣序列的Ｌｏｘｐ位點．將使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，導致原來表達紅色膜蛋白??的紅色細胞將因為的切除改為表達￡ＧＦＰ綠色膜蛋白而逐漸變成綠色。由此，該??模型以細胞表面明顯的紅綠熒光轉(zhuǎn)變，報告其內(nèi)部基因被編輯的事件．如圖２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??圖２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位點設計示意圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ轉(zhuǎn)基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ設計??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ質(zhì)粒設計并驗證靶向敲除如〇的引導ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列與兩段重復的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在設計敲??除的ｓｇＲＮＡ時．采用了兩種不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ設計在膜定位序列，Ｃａｓ９單酶切靶??向位點形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因為移碼突變而無法表達。２）?ｓｇＲＮＡ設汁在??重復的序列，Ｃａｓ９將在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ內(nèi)識別兩個耙向位點形成雙酶切，使兩個耙位點內(nèi)堿基??敲除，兩個靶位點同時發(fā)生片段插入或缺失使得其后的序列因為移碼突變而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位點設Ｕ？草圖如圖２－２所示，根據(jù)ｓｇＲＮＡ設計原則以及單酶切和雙??酶切兩種策略．分別設計１條單酶切和２條雙酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
的兩個同樣序列的Ｌｏｘｐ位點．將使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，導致原來表達紅色膜蛋白??的紅色細胞將因為的切除改為表達￡ＧＦＰ綠色膜蛋白而逐漸變成綠色。由此，該??模型以細胞表面明顯的紅綠熒光轉(zhuǎn)變，報告其內(nèi)部基因被編輯的事件．如圖２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??圖２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位點設計示意圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ轉(zhuǎn)基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ設計??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ質(zhì)粒設計并驗證靶向敲除如〇的引導ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列與兩段重復的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在設計敲??除的ｓｇＲＮＡ時．采用了兩種不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ設計在膜定位序列，Ｃａｓ９單酶切靶??向位點形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因為移碼突變而無法表達。２）?ｓｇＲＮＡ設汁在??重復的序列，Ｃａｓ９將在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ內(nèi)識別兩個耙向位點形成雙酶切，使兩個耙位點內(nèi)堿基??敲除，兩個靶位點同時發(fā)生片段插入或缺失使得其后的序列因為移碼突變而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位點設Ｕ？草圖如圖２－２所示，根據(jù)ｓｇＲＮＡ設計原則以及單酶切和雙??酶切兩種策略．分別設計１條單酶切和２條雙酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
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