黑曲霉作為一種重要的工業(yè)發(fā)酵微生物,廣泛應(yīng)用于食品及酶制劑等生產(chǎn)領(lǐng)域,但是其產(chǎn)生的真菌毒素一直威脅著人類的健康。本文擬研究黑曲霉全局調(diào)控因子veA及l(fā)aeA對(duì)赭曲霉毒素A（OTA）的生物合成、菌體的生長(zhǎng)發(fā)育和氧化脅迫下應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用,這將為有效控制黑曲霉的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒及進(jìn)一步探究黑曲霉中網(wǎng)絡(luò)調(diào)控提供理論參考依據(jù)。（1）本實(shí)驗(yàn)通過農(nóng)桿菌侵染的方法成功篩選出△veA及AlaeA菌株,通過基因組重測(cè)序的方法測(cè)定AveA及AlaeA菌株中潮霉素基因插入位置,證實(shí)潮霉素基因插入位置正確,插入方式為反向插入,基因拷貝數(shù)為1。經(jīng)穩(wěn)定性驗(yàn)證,AveA及AlaeA菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。（2）通過與黑曲霉A14表型特征對(duì)比,發(fā)現(xiàn)AveA及AlaeA菌株的產(chǎn)孢及菌落生長(zhǎng)直徑均有不同程度的減少,菌絲長(zhǎng)且松散,枝節(jié)相對(duì)較少,而分生孢子形態(tài)無明顯差異。（3）通過研究OTA的生物合成量,發(fā)現(xiàn)AveA菌株在生長(zhǎng)7d過程中均未能檢測(cè)到OTA,通過qRT-PCR分析OTA合成關(guān)鍵基因pks的表達(dá)情況,結(jié)果表明pks的表達(dá)與黑曲霉A14相比急劇減少;△laeA菌株的OTA合成量與野生菌株相比極大減少,在生長(zhǎng)第7 d,... 

【文章來源】：天津科技大學(xué)天津市

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２寄生曲霉中ＲＯＳ調(diào)控機(jī)制［６９］??Ｆｉｇ?１－２．?Ｐｒｏｐｏｓｅｄ?ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｏｔａｌ?ＲＯＳ?ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ?ｉｎ?Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ?ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ．??

２８７５?ｂｐ，為了能夠讓測(cè)序所得堿基序列更加準(zhǔn)確，在設(shè)計(jì)ｖｄ－ｆ／ｖｅＸ－ｒ時(shí)有目的的向兩??端延伸，使得兩引物理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為３２０１?ｂｐ；?ｖｅＪ－ｆ／ｖｄ－ｒ擴(kuò)增黑曲霉Ａ１４中ｖｅＪ基??因ＰＣＲ電泳圖如下圖３－１?（ａ）所示，擴(kuò)增結(jié)果與理論值大小相近。通過切膠回收的方??法對(duì)擴(kuò)增獲得的基因片段進(jìn)行回收，并連接到ＰＧＭ１８－Ｔ載體上，ＰＣＲ驗(yàn)證條帶??位置正確后，如下圖３－１?（ｂ）所示，送至華大測(cè)序。??Ｍ?１?２?３?Ｍｌ??５ｋｂ—??３ｋｂ—??５ｋｂ—??３ｋｂ—??Ｉｋｂ—Ｈ??Ｖｓ?１??（ａ）?（ｂ）??圖３－ｌｖｅｖ４基因的擴(kuò)增（ａ）及回收（ｂ）。??Ｆｉｇ．３－１?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?（ａ）?ａｎｄ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｔｅｓｔ?ｏｆ?ｐＧＭ１８－Ｔ－ｖ＾?（ｂ）．??注（ａ）?Ｍ：?５ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ，?１－３：?ｖｄ?基因?ＰＣＲ產(chǎn)物；Ｃｂ）?Ｍ：?５ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ，?１：以?ｐＧＭ１８－??�。觯錇槟０鍞U(kuò)增ｖｄ基因??３．１．２黑曲霉Ａ１４ｗＷ基因的測(cè)序及比對(duì)結(jié)果??對(duì)ｖｄ基因進(jìn)行測(cè)序，將ｖｄ兩端設(shè)計(jì)的多余的部分去掉后，將序列結(jié)果與ＮＣＢＩ??上黑曲霉ＣＢＳ５１３．８８己經(jīng)公布的ｖｄ基因進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)到１００％，這說明成功??擴(kuò)增出黑曲霉Ａ１４ｖｅｊ基因，比對(duì)結(jié)果見附錄１所示。??３６??

出了?ｖｄ的同源左右臂，比對(duì)結(jié)果見附錄２－１及２－２所示。??３．１．５黑曲霉Ａ１４?ｖｄ基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證??敲除質(zhì)粒ｐ４４－Ｖｅ』構(gòu)建示意圖如下圖３－３所示。按照２．２．４的實(shí)驗(yàn)操作，在質(zhì)粒??ｐ４４的基礎(chǔ)上構(gòu)建ｐ４４－ｖｅＪ敲除質(zhì)粒，首先通過及ｏＲ?Ｉ／Ｘｐｎ?Ｉ分別酶切ｐ４４及ｖｅｄ－Ｈｌ，??將酶切后的ｖｄ－Ｈｌ片段通過Ｔ４連接酶連接到酶切后的ｐ４４長(zhǎng)片段上，從而通過轉(zhuǎn)化??篩選出連接成功的ｐ４４－ｖｄ－Ｈｌ；?ｖｄ－Ｈ２利用５漏Ｈｌ／ｉ／ｚＷＩＩＩ同質(zhì)粒ｐ４４－ｖｄ－Ｈｌ同時(shí)??３７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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