本文關(guān)鍵詞：家蠶桿狀病毒多角體啟動子結(jié)合蛋白篩選及39k基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多角體基因是家蠶桿狀病毒(BmNPV)極晚期表達基因,因其啟動子的超高效的啟動功能,常被當(dāng)作昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中啟動外源基因表達的啟動子,但其高效啟動機制還鮮見報道。因此,在前期研究中,我們將多角體啟動子序列作為誘餌,利用酵母單雜交篩選出了多種能與多角體啟動子相互作用的蛋白因子,包括38K、39K、LEF5、P6.9、ORF60、ORF61、FP25、GP64、V-CATH。為進一步檢測上述蛋白因子對BmNPV多角體啟動子的調(diào)控作用,構(gòu)建了由BmNPV多角體啟動子驅(qū)動的螢火蟲螢光素酶和家蠶胞質(zhì)肌動蛋白A3啟動子驅(qū)動海腎螢光素酶的雙螢光素酶檢測系統(tǒng),通過定量檢測螢光素酶活性的變化篩選出多角體啟動子正調(diào)控因子LEF5,負(fù)調(diào)控因子39K和ORF61,其他因子調(diào)控作用不明顯。39k同源基因存在于所有鱗翅目昆蟲的桿狀病毒基因組中,其編碼產(chǎn)物為一種磷蛋白。迄今的研究表明,39k基因與病毒基因表達調(diào)控有關(guān),但家蠶核型多角體病毒(BmNPV)39k基因?qū)Σ《緩?fù)制和轉(zhuǎn)錄的具體調(diào)控作用尚不清楚,為了深入了解該基因的功能,我們檢測發(fā)現(xiàn)39k基因為早期轉(zhuǎn)錄基因,利用Red重組技術(shù)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別敲除和補回39k基因,構(gòu)建了39k缺失型病毒39k-ko-Bacmid和修復(fù)型病毒39k-re-Bacmid,并分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞,病毒滴度檢測結(jié)果顯示二者均能產(chǎn)生具有感染活力的病毒粒子,表明39k基因是BmNPV復(fù)制的非必需基因,但是該基因的缺失可顯著降低病毒滴度。進一步利用熒光定量qPCR技術(shù)進行檢測,發(fā)現(xiàn)39k基因缺失對病毒基因組早期基因組的復(fù)制沒有顯著影響,但在后期會降低病毒基因組的復(fù)制水平,并導(dǎo)致病毒各時期基因轉(zhuǎn)錄水平的極顯著下降(p0.01)。綜上所述,利用雙螢光素酶報告基因檢測出多角體啟動子正調(diào)控因子為LEF5,負(fù)調(diào)控因子為39K和ORF61,進一步研究可知39k基因是BmNPV復(fù)制的非必需基因,但該基因的缺失可顯著降低病毒各時期基因的轉(zhuǎn)錄水平,本研究將為深入了解BmNPV 39k基因?qū)Σ《净蚪M復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的影響奠定基礎(chǔ),同時也將為家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)錄機制的研究提供新基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：家蠶桿狀病毒 多角體基因啟動子 結(jié)合蛋白 39k基因 基因敲除 雙螢光素酶報告系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略語8-13
• 第一章 緒論13-17
• 1 桿狀病毒研究現(xiàn)狀13-15
• 1.1 桿狀病毒簡介13
• 1.2 桿狀病毒調(diào)控基因研究概況13-14
• 1.3 家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)簡介14-15
• 2 Red同源重組技術(shù)15-16
• 3 雙螢光素酶報告基因簡介16-17
• 第二章 實驗方案17-19
• 1 研究的目的和意義17
• 2 研究的主要內(nèi)容17-18
• 3 技術(shù)路線18-19
• 第三章 家蠶桿狀病毒多角體啟動子結(jié)合蛋白的篩選19-41
• 1 材料與試劑19-20
• 1.1 材料19
• 1.2 試劑19-20
• 1.3 試劑配制20
• 2 方法20-33
• 2.1 雙螢光素酶載體的構(gòu)建20-26
• 2.1.1 重組轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac Dual-A3-Rluc的構(gòu)建21-24
• 2.1.1.1 家蠶細(xì)胞基因組的提取21
• 2.1.1.2 重組轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac Dual-A3的構(gòu)建21-23
• 2.1.1.3 重組轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac Dual-A3-Rluc的構(gòu)建23
• 2.1.1.4 重組轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的構(gòu)建23-24
• 2.1.2 雙螢光素病毒載體wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的構(gòu)建24-26
• 2.1.2.1 DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞的制備24
• 2.1.2.2 供體質(zhì)粒p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的轉(zhuǎn)化24-25
• 2.1.2.3 雙螢光素病毒載體wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的鑒定25-26
• 2.2 目的蛋白過表達載體的構(gòu)建26-28
• 2.2.1 重組過表達載體的構(gòu)建26-27
• 2.2.2 Western blotting檢測篩選蛋白在家蠶細(xì)胞中過表達27-28
• 2.3 目的蛋白過表達對Bm NPV多角體啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控28-29
• 2.3.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的過表達載體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞28-29
• 2.3.2 雙螢光素酶活性檢測29
• 2.4 39k、lef5、orf61基因缺失型雙螢光素酶病毒載體的構(gòu)建29-32
• 2.4.1 p KD46質(zhì)粒提取29-30
• 2.4.2 p KD46質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化30
• 2.4.3 含p KD46的DH10Bac感受態(tài)的制備30
• 2.4.4 39k、lef5、orf61基因打靶片段的制備30-31
• 2.4.5 39k、lef5、orf61基因缺失型雙螢光素酶病毒載體的構(gòu)建31
• 2.4.6 39k、lef5、orf61基因缺失型雙螢光素酶病毒載體的鑒定31-32
• 2.5 39k、lef5、orf61基因缺失對Bm NPV多角體啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控32-33
• 2.5.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的敲除型Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞32
• 2.5.2 雙螢光素酶活性檢測32-33
• 3 結(jié)果與分析33-39
• 3.1 重組轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的PCR鑒定33-34
• 3.2 雙螢光素病毒載體wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的PCR鑒定34
• 3.3 過表達載體的PCR鑒定34-35
• 3.4 目的蛋白過表達的Western blotting分析35-36
• 3.5 目的蛋白過表達對Bm NPV多角體啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控36-37
• 3.6 39k、lef5、orf61基因缺失型雙螢光素酶病毒載體的鑒定37-38
• 3.7 39k、lef5、orf61基因缺失對Bm NPV多角體啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控38-39
• 4 討論39-41
• 第四章 家蠶桿狀病毒 39k基因功能研究41-61
• 1 材料與試劑41-42
• 1.1 材料41
• 1.2 試劑41
• 1.3 試劑配制41-42
• 2 方法42-49
• 2.1 39k基因的序列分析42
• 2.2 39k基因的轉(zhuǎn)錄時相42-43
• 2.2.1 家蠶細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)42
• 2.2.2 Bm NPV病毒感染Bm N細(xì)胞的總RNA的提取42-43
• 2.2.3 c DNA第一鏈的合成43
• 2.2.4 39k基因的轉(zhuǎn)錄時相43
• 2.3 39k基因缺失型和修復(fù)型病毒的構(gòu)建43-45
• 2.3.1 39k基因缺失型Bacmid的構(gòu)建43-44
• 2.3.2 39k基因修復(fù)型Bacmid的構(gòu)建44-45
• 2.3.2.1 轉(zhuǎn)移載體p Fast Bac- 39k的構(gòu)建44
• 2.3.2.2 39k基因修復(fù)型Bacmid的構(gòu)建44-45
• 2.4 39k基因缺失對Bm NPV病毒滴度的影響45-46
• 2.4.1 堿裂解法提取重組Bacmid45
• 2.4.2 重組Bacmid轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞45
• 2.4.3 病毒滴度的測定45-46
• 2.5 39k基因缺失對Bm NPV病毒基因組復(fù)制情況檢測46-48
• 2.5.1 Bm NPV病毒基因組的提取46-47
• 2.5.2 q PCR檢測Bm NPV病毒基因組復(fù)制情況47
• 2.5.3 q PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制47
• 2.5.4 q PCR檢測Bm NPV病毒基因組復(fù)制情況47-48
• 2.6 39k基因缺失對Bm NPV基因轉(zhuǎn)錄的影響48-49
• 2.6.1 重組Bacmid轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞48
• 2.6.3 Bm NPV病毒感染Bm N細(xì)胞的總RNA的提取及c DNA制備48
• 2.6.4 q PCR檢測 39k基因缺失對Bm NPV各時期基因轉(zhuǎn)錄的影響48-49
• 3 結(jié)果與分析49-59
• 3.1 39k基因序列分析49-50
• 3.2 39K蛋白氨基酸同源性比對50-52
• 3.3 39k基因的轉(zhuǎn)錄時相52
• 3.4 39k基因缺失型Bacmid的鑒定52-53
• 3.5 39k基因修復(fù)型Bacmid的鑒定53-54
• 3.6 39k基因缺失型Bm NPV感染細(xì)胞的情況54-55
• 3.7 39k基因缺失對Bm NPV病毒滴度的影響55-56
• 3.8 39k基因缺失對Bm NPV基因組復(fù)制的影響56-57
• 3.9 39k基因缺失對Bm NPV基因轉(zhuǎn)錄的影響57-59
• 4 討論59-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-67
• 附錄67-69
• 致謝69

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本文編號：345472