為了構(gòu)建GLRX3（Glutaredoxin 3）敲除的HEK293細(xì)胞系,根據(jù)該蛋白結(jié)構(gòu)特性設(shè)計(jì)了靶向于GLRX3基因Exon5的4個(gè)sgRNA,并通過(guò)T7E1檢測(cè)確認(rèn)了所設(shè)計(jì)sgRNA的有效性。將攜帶Cas9及靶向hGLRX3-Exon5的sgRNA1的打靶載體轉(zhuǎn)染HEK293,通過(guò)藥物Puromycin和細(xì)胞克隆化篩選出穩(wěn)定GLRX3基因敲除的HEK293細(xì)胞株,并通過(guò)測(cè)序確定GLRX3兩個(gè)等位基因均發(fā)生移碼突變。通過(guò)免疫印跡在蛋白表達(dá)水平確認(rèn)了該基因的敲除。利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了GLRX3敲除的HEK293細(xì)胞株,其為探索GLRX3的功能和作用機(jī)制提供了有效的細(xì)胞模型。 

【文章來(lái)源】：陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017,45(01)北大核心CSCD

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞株和載體
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.1.3 引物合成和測(cè)序
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.2 sgRNA打靶效率的檢測(cè)
        1.2.3 用于GLRX3基因敲除的打靶載體的構(gòu)建
        1.2.4 構(gòu)建GLRX3敲除的HEK293細(xì)胞系
        1.2.5 免疫印跡檢測(cè)
2 結(jié)果
    2.1 用于human GLRX3基因敲除的打靶載體的構(gòu)建
    2.2 hGLRX3基因敲除HEK293細(xì)胞的建立
3 討論
4 結(jié)論



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