目的1.構(gòu)建慢病毒載體（Lentivirus vector,LV）介導(dǎo)的血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）重組過表達(dá)病毒（LV-HO-1）并利用其轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞;2.探討LV-HO-1對RPE細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用;3.探討LV-HO-1對RPE細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的機(jī)制。方法1.構(gòu)建HO-1過表達(dá)的重組慢病毒載體;2.建立RPE凋亡模型:選擇24h作為單一凋亡時間,正常RPE細(xì)胞H₂O₂半抑制濃度（IC50=209umol H₂O₂）作為最適凋亡濃度,建立RPE凋亡模型。3.按不同處理因素將RPE細(xì)胞分為四組:空白對照組:正常培養(yǎng)RPE細(xì)胞;單純損傷組:正常RPE細(xì)胞經(jīng)H₂O₂誘導(dǎo)凋亡;空載體-RPE組:慢病毒介導(dǎo)空載體轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞;HO-1-RPE組:慢病毒介導(dǎo)HO-1基因轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞;4.應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)法繪制各組RPE細(xì)胞生長曲線;5.熒光顯微鏡觀察各組RPE細(xì)胞熒光信號表達(dá)情況;CCK-8（Cell Counting ... 

【文章來源】：福建醫(yī)科大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

1LV-HO-1測序結(jié)果

13圖3.1.2LV-HO-1測序結(jié)果比對3.2ARPE-19細(xì)胞經(jīng)光鏡鑒定第三代ARPE-19細(xì)胞株，細(xì)胞傳代起第五天，細(xì)胞呈單層貼壁成長，細(xì)胞體積小，形態(tài)呈長形，多角形及橢圓形，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞內(nèi)含豐富的黑色顆粒，胞漿呈半透明狀，細(xì)胞排列并不緊密，間有縫隙存在（如圖3.2.1）。錯誤!未指定書簽。圖3.2.1.P3視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株（×100）Fig3.2.1.P3day5retinalpigmentepithelium（×100）3.3HO-1重組慢病毒滴度測定及熒光顯微鏡鑒定慢病毒Lv-RNA-HO-1病毒滴度的測定結(jié)果：將病毒MOI值（感染復(fù)數(shù)）梯度分別設(shè)置為3、6、9，經(jīng)病毒感染后待293T細(xì)胞的融合率達(dá)到90%，觀察到MOI值為9的分組熒光較強(qiáng)但細(xì)胞狀態(tài)較差；MOI值為3的分組熒光強(qiáng)度太弱，MOI值為6的分組細(xì)胞狀態(tài)較好，選擇MOI值為6的分組進(jìn)行后續(xù)實驗（圖3.3.1-3.3.4），熒光百分比在10~30%之間，計算滴度為0.033μl，滿足下一步實驗需要。（滴度（tu/ml）=細(xì)胞數(shù)*熒光百分比*MOI(1)*病毒稀釋倍數(shù)*10^3）

13圖3.1.2LV-HO-1測序結(jié)果比對3.2ARPE-19細(xì)胞經(jīng)光鏡鑒定第三代ARPE-19細(xì)胞株，細(xì)胞傳代起第五天，細(xì)胞呈單層貼壁成長，細(xì)胞體積小，形態(tài)呈長形，多角形及橢圓形，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞內(nèi)含豐富的黑色顆粒，胞漿呈半透明狀，細(xì)胞排列并不緊密，間有縫隙存在（如圖3.2.1）。錯誤!未指定書簽。圖3.2.1.P3視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株（×100）Fig3.2.1.P3day5retinalpigmentepithelium（×100）3.3HO-1重組慢病毒滴度測定及熒光顯微鏡鑒定慢病毒Lv-RNA-HO-1病毒滴度的測定結(jié)果：將病毒MOI值（感染復(fù)數(shù)）梯度分別設(shè)置為3、6、9，經(jīng)病毒感染后待293T細(xì)胞的融合率達(dá)到90%，觀察到MOI值為9的分組熒光較強(qiáng)但細(xì)胞狀態(tài)較差；MOI值為3的分組熒光強(qiáng)度太弱，MOI值為6的分組細(xì)胞狀態(tài)較好，選擇MOI值為6的分組進(jìn)行后續(xù)實驗（圖3.3.1-3.3.4），熒光百分比在10~30%之間，計算滴度為0.033μl，滿足下一步實驗需要。（滴度（tu/ml）=細(xì)胞數(shù)*熒光百分比*MOI(1)*病毒稀釋倍數(shù)*10^3）

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Rosmarinic acid elicits neuroprotection in ischemic stroke via Nrf2 and heme oxygenase 1 signaling[J]. Hai-Ying Cui,Xiang-Jian Zhang,Yi Yang,Cong Zhang,Chun-Hua Zhu,Jiang-Yong Miao,Rong Chen.  Neural Regeneration Research. 2018(12)
[2]膽紅素對急性肺損傷大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞核因子κB,細(xì)胞間粘附分子1表達(dá)的影響[J]. 李建強(qiáng),高曉玲,劉卓拉,徐永健,張珍祥.  中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志. 2004(01)



本文編號：3443548