目的克隆馬藍(lán)Baphicacanthus cusia吲哚類生物堿合成途徑的色氨酸合成酶（tryptophan synthase,TSB）基因,命名為BcTSB（GenBank登錄號(hào)AYM45644.1）,對(duì)其生物信息學(xué)和表達(dá)進(jìn)行分析。方法基于前期馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,獲得BcTSB基因開放閱讀框（ORF）,運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)基因功能做出初步預(yù)測(cè),構(gòu)建pET32a-BcTSB原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)馬藍(lán)不同組織（根、莖、葉）中TSB表達(dá)水平。結(jié)果克隆的BcTSB基因ORF長度為1452bp,編碼483個(gè)氨基酸,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為親水性蛋白,定位于葉綠體,該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為51 665.89,pET-32a載體包含18 000的標(biāo)簽。SDS-PAGE分析在70 000處出現(xiàn)目的蛋白條帶,與理論預(yù)期值大小一致。qRT-PCR分析顯示BcTSB基因在馬藍(lán)不同組織中均有表達(dá),且在莖中的表達(dá)量最高。結(jié)論通過對(duì)BcTSB基因的克隆及表達(dá)分析,為進(jìn)一步研究該基因功能及調(diào)控奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中草藥. 2020,51(24)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

馬藍(lán)RNA凝膠電泳(A)和Bc TSB基因(B) PCR擴(kuò)增

通過NCBI在線Blastp對(duì)蛋白進(jìn)行同源序列搜索，選取獨(dú)腳金（GER52969.1）等16種不同物種的TSB氨基酸序列，采用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸進(jìn)行氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖5），發(fā)現(xiàn)Bc TSB蛋白與其他蛋白保守區(qū)域相似性最高達(dá)到88%，表明Bc TSB蛋白的保守性較高。利用MEGA 6.0軟件的NJ法，構(gòu)建不同生物TSB的進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bc TSB基因與藥用植物獨(dú)腳金（GER52969.1）、紅鼠尾草（TEY67686.1）親緣關(guān)系較近，可聚為一支（圖6）。圖3 馬藍(lán)Bc TSB蛋白親疏水性、結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

馬藍(lán)Bc TSB蛋白親疏水性、結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]馬藍(lán)吲哚類生物堿合成關(guān)鍵基因ASA和ASB的克隆與功能研究[D]. 張青磊.華僑大學(xué) 2017
[2]不同外源物質(zhì)處理對(duì)馬藍(lán)生理特性以及有效成分含量的影響[D]. 可曉旭.福建農(nóng)林大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3435587