利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定向改良水稻稻瘟病抗性
發(fā)布時間：2021-10-12 14:00
水稻作為世界上食用人口最多的農(nóng)作物,其產(chǎn)量每年都會因稻瘟病的流行而減產(chǎn)。目前,控制稻瘟病爆發(fā)的有效策略就是使用抗性品種。近年來,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的誕生解決了傳統(tǒng)育種過程中育種年限及連鎖累贅等問題,為作物遺傳改良提供了新的育種平臺。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻Pita,Pi21和ERF922稻瘟病相關(guān)基因進(jìn)行定點編輯,以期獲得能夠穩(wěn)定遺傳的抗抗稻瘟病水稻材料。本研究主要結(jié)果如下:1.Pi21基因是在隱性狀態(tài)下發(fā)揮對稻瘟病菌的抗性,而ERF922則負(fù)調(diào)控稻瘟病菌的抗性,Pita對稻瘟病的抗感差異是由于第918位氨基酸位點的變化而引起。我們選擇3個基因的第一外顯子靠近ATG附近的序列作為靶序列構(gòu)建共編輯載體pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922,用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化長粒粳稻恢復(fù)系L1014。在T0代轉(zhuǎn)基因陽性株中,Pita,Pi21和ERF922三個基因發(fā)生突變的頻率分別為75%,85%和75%,Pita發(fā)生突變的基因型多為雙等位突變（47.1...
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁數(shù)】：57 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
1植物PTI和ETI過程中的普遍作用機制（Tsudaetal.,2012）
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言鋅指蛋白能夠特異性的識別 DNA 序列上的三個連續(xù)的堿基，通常是將 3-6 個鋅指蛋白串聯(lián)起來去特異識別 DNA 序列上的 9-18 個相鄰的堿基；FokI 是一種來源于海床黃桿菌的 IIS 型限制性內(nèi)切酶，僅在形成二聚體結(jié)構(gòu)的條件下，才能實現(xiàn)其切割功能。兩者通過人工組裝形成鋅指核酸酶，在將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞前，先在體外通過噬菌體展示等技術(shù)篩選具有與靶序列特異性切割活性的鋅指，隨后再導(dǎo)入受體生物中，特異性的切割靶基因從而促使細(xì)胞進(jìn)行同源重組和非同源末端連接修復(fù)，產(chǎn)生不同類型的定點突變（圖 1.3.1）。基于此，ZFN 技術(shù)很快便應(yīng)用到斑馬魚、植物細(xì)胞及基因治療的研究上（Doyon et al., 2008；Wright et al.,2005；Urnov etal.,2005）。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言酸數(shù)為 63 時，其兩翼的堿基數(shù)則為 14-23 bp，然而，Miller 等（2011）研究表明，兩個 TALE結(jié)構(gòu)域間的堿基距離為 14-19 bp 時有最大的剪切效率。相較于 ZFN 技術(shù)，類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶在 DNA 序列特異性識別上更具靈活性，構(gòu)造過程簡便，剪切效率大大提高，廣泛應(yīng)用于不同物種的基因編輯，包括斑馬魚（Yang et al.,2017）、擬南芥（Christian et al., 2013）、水稻（Shanet al.,2015）等基因組的定點編輯。Yang 等（2017）以斑馬魚的 Foxl2 基因為靶標(biāo)獲得兩種能穩(wěn)定遺傳的不同突變類型的斑馬魚純合系；Christian 等（2013）利用 TALEN 系統(tǒng)對擬南芥的五個基因：ADH1、TT4、MAPKKK1、DSK2B 和 NATA2 進(jìn)行編輯，轉(zhuǎn)基因株系體細(xì)胞突變頻率高達(dá) 41-73%；Shan 等（2015）通過 TALEN 技術(shù)編輯水稻的香味基因 OsBADH2 來改良水稻香味品質(zhì)。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻pi21基因編輯材料的創(chuàng)制及稻瘟病抗性鑒定[J]. 楊海河,畢冬玲,張玉,鄒小維,高曉慶,袁正杰,曲海艷,何海燕,瞿紹洪. 分子植物育種. 2017(11)
[2]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻Pi21基因的效率分析[J]. 王芳權(quán),范方軍,李文奇,朱金燕,王軍,仲維功,楊杰. 中國水稻科學(xué). 2016(05)
[3]分子標(biāo)記輔助培育水稻抗白葉枯病和稻瘟病三基因聚合系[J]. 倪大虎,易成新,李莉,汪秀峰,張毅,趙開軍,王春連,章琦,王文相,楊劍波. 作物學(xué)報. 2008(01)
[4]利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合3個稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 陳紅旗,陳宗祥,倪深,左示敏,潘學(xué)彪,朱旭東. 中國水稻科學(xué). 2008(01)
[5]水稻基因組中抗病基因正選擇方式及基因轉(zhuǎn)換的研究[J]. 季軍,楊四海,田大成. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2007(09)
博士論文
[1]稻瘟病菌定向選擇的分子證據(jù)和抗稻瘟病近等基因累加系的分子選育[D]. 何月秋.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 1999
本文編號：3432716
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁數(shù)】：57 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
1植物PTI和ETI過程中的普遍作用機制（Tsudaetal.,2012）
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言鋅指蛋白能夠特異性的識別 DNA 序列上的三個連續(xù)的堿基，通常是將 3-6 個鋅指蛋白串聯(lián)起來去特異識別 DNA 序列上的 9-18 個相鄰的堿基；FokI 是一種來源于海床黃桿菌的 IIS 型限制性內(nèi)切酶，僅在形成二聚體結(jié)構(gòu)的條件下，才能實現(xiàn)其切割功能。兩者通過人工組裝形成鋅指核酸酶，在將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞前，先在體外通過噬菌體展示等技術(shù)篩選具有與靶序列特異性切割活性的鋅指，隨后再導(dǎo)入受體生物中，特異性的切割靶基因從而促使細(xì)胞進(jìn)行同源重組和非同源末端連接修復(fù)，產(chǎn)生不同類型的定點突變（圖 1.3.1）。基于此，ZFN 技術(shù)很快便應(yīng)用到斑馬魚、植物細(xì)胞及基因治療的研究上（Doyon et al., 2008；Wright et al.,2005；Urnov etal.,2005）。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言酸數(shù)為 63 時，其兩翼的堿基數(shù)則為 14-23 bp，然而，Miller 等（2011）研究表明，兩個 TALE結(jié)構(gòu)域間的堿基距離為 14-19 bp 時有最大的剪切效率。相較于 ZFN 技術(shù)，類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶在 DNA 序列特異性識別上更具靈活性，構(gòu)造過程簡便，剪切效率大大提高，廣泛應(yīng)用于不同物種的基因編輯，包括斑馬魚（Yang et al.,2017）、擬南芥（Christian et al., 2013）、水稻（Shanet al.,2015）等基因組的定點編輯。Yang 等（2017）以斑馬魚的 Foxl2 基因為靶標(biāo)獲得兩種能穩(wěn)定遺傳的不同突變類型的斑馬魚純合系；Christian 等（2013）利用 TALEN 系統(tǒng)對擬南芥的五個基因：ADH1、TT4、MAPKKK1、DSK2B 和 NATA2 進(jìn)行編輯，轉(zhuǎn)基因株系體細(xì)胞突變頻率高達(dá) 41-73%；Shan 等（2015）通過 TALEN 技術(shù)編輯水稻的香味基因 OsBADH2 來改良水稻香味品質(zhì)。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻pi21基因編輯材料的創(chuàng)制及稻瘟病抗性鑒定[J]. 楊海河,畢冬玲,張玉,鄒小維,高曉慶,袁正杰,曲海艷,何海燕,瞿紹洪. 分子植物育種. 2017(11)
[2]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻Pi21基因的效率分析[J]. 王芳權(quán),范方軍,李文奇,朱金燕,王軍,仲維功,楊杰. 中國水稻科學(xué). 2016(05)
[3]分子標(biāo)記輔助培育水稻抗白葉枯病和稻瘟病三基因聚合系[J]. 倪大虎,易成新,李莉,汪秀峰,張毅,趙開軍,王春連,章琦,王文相,楊劍波. 作物學(xué)報. 2008(01)
[4]利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合3個稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 陳紅旗,陳宗祥,倪深,左示敏,潘學(xué)彪,朱旭東. 中國水稻科學(xué). 2008(01)
[5]水稻基因組中抗病基因正選擇方式及基因轉(zhuǎn)換的研究[J]. 季軍,楊四海,田大成. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2007(09)
博士論文
[1]稻瘟病菌定向選擇的分子證據(jù)和抗稻瘟病近等基因累加系的分子選育[D]. 何月秋.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 1999
本文編號：3432716
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